可托多松生物羟化反应研究及羟化酶基因的获取与表达

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甾体化合物又称类固醇,在动植物中普遍存在。许多甾体化合物都是临床上极为重要的激素类药物,具有十分独特的生理功能。在二十世纪下半叶以来,甾体类药物的产量仅次于抗生素,成为第二大类药物。通过对甾体分子环或支链的一些生物或化学改造,可以得到许多有药用价值的甾体化合物。这些经过修饰的化合物,通常具有更好的疗效,如具有更高的药效、更长的半衰期及更小的副作用。相较于化学合成,微生物几乎可以对甾体化合物的任何位置进行修饰,且具有更高的区域和立体选择性,能够避免使用强酸强碱以及一些有毒化学试剂,因此微生物转化为甾体衍生物的合成提供了一种经济而又有效的方式。目前已经鉴定的有潜在作用的甾体化合物的数量可能已经超过5000种,但人们仍致力于发现各种结构新颖的甾体化合物及分离具有实际需要的转化能力的微生物。  19-OH-甾体是合成19-去甲甾体的重要中间体,而后者可用于合成高效甾体激素药物,如炔诺酮、米非司酮等。这些药物对于推行我国计划生育政策,提高人口质量,增进人民的健康水平和促进社会的稳定发展都具有极其重要的现实意义。  目前所报道的可催化甾体19位羟化的微生物仅有1961年Hasegawa等人筛选得到一株丝核薄膜革菌(Thanatephorus cucumeris(Frank) Donk),可催化转化可托多松生成19-OH-可托多松和11β-可托多松。本课题在实验过程中发现该菌在转化可托多松过程中,除了产生上述两种产物以外,还产生一种极性与19-OH-可托多松非常相近的产物7-OH-可托多松。为了得到大量的目标产物19-OH-可托多松和11β-OH可托多松,对菌体培养条件和转化条件进行了控制和优化,确定了可托多松转化的最佳条件:初始pH9.0、装液量40%、助溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(0.5%,v/v)、底物投加时间48h。该条件下几乎不产生7-OH-可托多松,19-OH可托多松和11β-OH-可托多松的比例约为1∶0.74,底物浓度为0.5 g/L,转化60 h,19-OH可托多松的产量可达到117mg/L左右,11β-OH可托多松产量可达到86mg/L左右。  通过对Thanatephorus cucumeris转录组分析,获得了底物可托多松诱导后表达水平上调的7个P450酶基因以及两个CPR基因,并进行反转录获得这9个基因,将最有可能为可托多松19位羟化酶的P450-2基因进与TrxA进行融合表达表达,成功表达出目的蛋白。此蛋白的成功表达为下一步的纯化、活性测定以及体外构建代谢体系等提供了一定基础。
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