低温是一种很重要的非生物胁迫因子，限制农作物的生长、产量和地理分布。茶树喜温畏寒，我国大部分茶区冬季极端的低温冻害和春、秋季突发的霜冻经常发生，严重影响茶叶产量及品质。如何提高茶树抗寒性，一直是茶叶生产与理论研究上迫切需要解决的问题。因此，研究与了解茶树低温胁迫下的抗逆机制，有针对性地发掘相关抗逆基因并加以利用，是近年来茶树栽培育种研究领域中的一个热点。本文应用抑制差减杂交技术，构建茶树SSH文库，发掘与筛选了一批茶树抗寒相关EST，用RACE技术克隆出一种茶树脱水素基因，用荧光定量PCR分析其表达特性，用纯化的重组蛋白鉴定了其体外功能，并通过在烟草中过量表达研究了其抗逆性。这些研究结果将对解析茶树响应低温的基因表达网络，研究与了解脱水素参与茶树抗逆的作用，开展茶树抗寒分子育种工作有着积极意义。论文取得以下主要结论：　　 1、以茶树叶片愈伤组织为材料，采用25℃与-5℃处理，成功构建了茶树低温胁迫SSH文库。随机从正库与反库分别取384个克隆，采用斑点杂交筛选技术，最终获得了差异表达的UniESTs序列247条，Genbank登录号为：JK264877～JK265128。　　 2、参照MIPS分类法，UniESTs可分为7个大类，15个小类。其中，未知功能蛋白与无匹配的序列占30％，已知功能中比例最高的为细胞信号转导的基因，占25.9％，其次是感知与响应刺激的占18.6％，而与转运和植物发育的基因较少，只占4.5％和3.6％。这些基因主要包括：胁迫相关蛋白22条、活性氧清除酶类3条、糖、蛋白质和脯氨酸等渗调物质合成酶类12条、细胞壁合成相关7条、脂代谢酶类7条、信号转导相关的22条、物质运输相关的7条、转录因子和翻译调控相关的60条以及参与能量代谢与次生代谢基因14条等。　　 3、利用RT-PCR和3’/5’RACE技术，首次克隆出一种茶树脱水素基因CsDHN1，获得登录号FJ436978。其cDNA全长960 bp，开放阅读框606 bp，编码的蛋白质为201 aa，其分子量约为21 kD，等电点为8-3。CsDHN1蛋白质组成中，Gly占20.9％，Thr占18.4％，Lys占7.0％，His占6.0％，而没有Cys、Trp。茶树脱水素基因含有2个Y片段，1个S片段，2个K片段，属于Y2SK2型脱水素。该序列与多种已知植物的脱水素基因相比，有37.4％～54.7％的同源性。通过分子生物信息学分析，该脱水素蛋白无疏水区、无跨膜区、无信号肽，不是膜蛋白，而可能是一种胞质蛋白。　　 4、茶树脱水素基因CsDHN1为组成型表达，在逆境及ABA诱导下可上调其转录水平。4℃低温处理下表达量可提高4.2倍，而脱水处理能提高93.4倍CsDHN1对脱水、高盐胁迫的响应程度优于低温胁迫。在茶树各组织器官中CsDHN1都有表达，其中种子中表达量最高，为叶片的11.2倍。　　 5、构建了pET32a-CsDHN1表达载体，在Rosetta(DE3)plysS表达宿主菌中成功表达出可溶性茶树脱水素Cs DHN1融合蛋白(约45 kD)。诱导表达条件为：37℃，0.5 mM IPTG诱导6 h。采用亲和层析方法，用Ni-NTA Purification System纯化获得纯度为98％目的重组蛋白。多克隆抗体anti-deyhydrin与重组蛋白可发生免疫杂交，证实所克隆的功能基因为脱水素。　　 6、在脱水和冻融处理中，纯化的茶树脱水素CsDHN1重组蛋白对MDH、LDH活性有明显的保护作用，当蛋白与酶比例为4时，可分别维持84.4％、47％的酶活性，抗脱水作用优于在低温下的保护作用。茶树脱水素CsDHN1在冷冻与脱水条件，具有稳定蛋白质结构的作用。　　 7、构建了茶树脱水素基因CsDHN1植物表达载体，通过农杆菌叶盘转化法将其导入烟草中，获得了转基因植株。PCR分子检测表明该基因已整合到烟草基因组DNA，并能正常转录。　　 8、转基因烟草的保水力及抗渗透胁迫能力较强，表现出良好的抗旱性。转基因烟草叶片离体20 h后失水率仅为36.9％，而非转基因达到60.3％；20％PEG6000渗透胁迫24 h后，转基因烟草叶片渗透势仅降低14.0ff，0，而非转基因达到了66.7％，出现严重萎蔫。转基因烟草的抗寒性得到了提高。-4℃低温胁迫下，非转因与转基因烟草叶绿素含量、Fv/Fm均明显下降，处理12 h后非转因烟草分别降低了31-33％、32.98％，而转基因烟草只下降了16.67％、16.77％。