Micro RNA167(miR167)是植物体内生长素响应因子(ARF)基因的重要表达调控因子之一,参与植物生长发育以及外界胁迫应答。前期研究中我们发现拟南芥miR167通过调控ARF6和ARF8的表达参与花发育调控。在不改变氨基酸编码序列的情况下,我们将ARF6和ARF8中miR167的靶位点进行定点突变(mARF6、mARF8),发现ARF6和ARF8在mARF6和mARF8突变体花药中表达量增加,突变体花药不开裂。茉莉酸是影响花药开裂的主要因素之一,主要在花丝中合成,能够促进花丝上部区域吸收花药组织水分引起花药脱水干燥以及引发花药表皮层对茉莉酸的感知,从而引起花药开裂。茉莉酸合成依赖ARF6和ARF8在花丝中的表达;arf6 arf8双突变体中茉莉酸合成受阻,导致花丝变短,花药不开裂,对arf6 arf8双突变体外施茉莉酸能引发花药开裂。然而对mARF6和mARF8突变体外施茉莉酸不能引发花药开裂。表明arf6 arf8和mARF6(或mARF8)突变体在调控花药开裂中存在不同调控机制。此外,有研究发现miR167在玉米胚乳发育过程中差异表达,表明miR167可能参与胚乳发育调控;然而,其调控机制并不清楚。因此,本研究分别以拟南芥花药和玉米胚乳为材料,深入探究miR167对花药开裂和胚乳发育的影响与调控机制。主要结果如下:1.本研究首先创制与鉴定了拟南芥miR167靶位点弱突变体和mir167突变体。mARF6和mARF8弱突变株系杂合植株花药开裂延迟,育性降低。miR167家族共有四个成员,即miR167a、miR167b、miR167c和miR167d。为明确miR167不同成员对花药的调控作用,我们将MIR167启动子与GUS基因融合的转基因植株进行GUS基因的时空表达分析。X-Gluc染色结果表明,仅miR167a在花药中表达强烈。利用CRISPR/Cas9系统对拟南芥MIR167a基因进行敲除后,发现mir167a突变体与mARF6和mARF8弱突变株系的表型相似。以上结果表明,在花药中,MIR167a是MIR167基因家族靶向调控转录因子ARF6和ARF8的主要成员;MIR167a调控作用缺失,花药开裂延迟。2.为明确拟南芥miR167调控作用缺失引起的花药表型差异,我们利用组织细胞学方法对miR167缺失突变体进行了表型观察与分析。组织及细胞形态观察显示miR167缺失突变体花药于第11期时开始异常生长,花药细胞异常增大。研究表明,生长素可以直接作用于细胞膜或膜内组分,进而影响细胞的扩大。为探究miR167缺失突变体花药细胞的膨大是否与受生长素应答有关,我们将生长素响应启动子DR5与GUS基因融合的转基因植株分别与mARF6和mARF8突变体植株杂交,观察GUS基因的时空表达。X-Gluc染色结果表明,mARF6和mARF8突变体具有生长素响应增强的表型。同时,植物体内各器官和组织间必须有物质的相互交换,交换速率越快,生长速度也就越快。为探究miR167缺失突变体花药细胞的膨大是否与花药中物质运输有关,我们将韧皮部特异表达基因SUC2启动子与YPET报告基因融合的载体转化拟南芥,并将转基因植株分别与mARF6和mARF8突变体植株杂交,通过观测YPET报告基因在花药韧皮部的特异表达判断在突变体中物质运输是否有差异。共聚焦显微镜结果显示,荧光信号在mARF6和mARF8突变体花药微管结构区域表达时间和分布长度较野生型增加,表明突变体花药内部大量的物质运输可能为花药持续生长提供物质基础。另外,药室内壁木质素的填充也影响花药开裂。间苯三酚木质素染色结果显示,mARF6和mARF8突变体染色区域与野生型无显著差异,表明突变体花药开裂延迟与药室内壁木质素积累无关。以上表明,miR167缺失突变体花药过度膨大表现为花药细胞的膨大,与花药体内生长素响应和物质运输量呈正相关。3.拟南芥ARF6和ARF8是一类转录激活因子,在miR167缺失突变体花药中异位表达,可能引起下游作用基因的上调表达。为鉴定参与调控miR167缺失突变体花药膨大的相关基因,我们采用RNA-Seq以及基因组织特异性表达等方法进行分析。通过对野生型、PRPS5a>MIR167a(MIR167a过表达植株)和mARF8突变体雄蕊进行RNA-Seq,我们鉴定到在mARF8突变体中上调表达且在PRPS5a>MIR167a中下调表达的102个差异基因。GO功能富集分析表明,差异基因主要为茉莉酸响应和细胞壁疏松相关基因,这些上调表达基因参与调控突变体花药细胞的过度生长。为验证这些基因在突变体花药中上调表达,我们我们将候选基因启动子与GUS基因融合的转基因植株分别与mARF6和mARF8突变体植株杂交,观察GUS基因的时空表达。X-Gluc染色结果表明,XTH19和EXPA8在mARF6或mARF8突变体花药中异位表达。以上结果表明,EXPA8和XTH19等基因在mARF6或mARF8突变体花药中上调表达,参与调控花药生长。4.为明确拟南芥miR167调控花药开裂的方式,我们探索了引发miR167缺失突变体花药开裂的条件。对拟南芥miR167缺失突变体花药干燥处理后,花药开裂,花粉释放;高湿条件下野生型花药则延迟开裂。因此,miR167缺失突变体花药延迟开裂可能是由于花药持续生长引起花药水分含量过高造成的。表明miR167能够抑制花药生长,促进花药开裂。为探究miR167调控花药开裂是否与依赖茉莉酸信号转导途径,我们将MIR167a启动子与GUS基因融合的转基因植株分别与茉莉酸途径相关突变体植株杂交,观察GUS基因的时空表达。X-Gluc染色结果表明,GUS基因的表达在茉莉酸途径相关突变体花药中与野生型无差异。qPCR结果显示,miR167在茉莉酸合成突变体中的表达量与野生型无显著差异。以上结果表明,miR167通过限制花药生长,促进花药干燥与开裂,该过程不依赖茉莉酸信号作用通路。5.为探究miR167在玉米胚乳发育过程中重要作用及调控路径,我们分析了miR167表达模式以及鉴定了miR167的靶基因。玉米胚乳小分子RNA文库测序显示miR167在灌浆前后差异表达。MIR167a表达模式表明,MIR167a在玉米胚乳发育过程中呈上调表达趋势。为明确miR167在胚乳中的靶基因,我们通过降解组测序、瞬时表达验证、进化树分析和表达模式分析等,确定ARF9和ARF18为miR167的靶基因。ARF18同样是一类转录激活因子,在胚乳发育过程中可能通过激活下游作用基因的表达参与胚乳发育调控。为探究ARF9和ARF18的下游作用基因,我们通过基因瞬时表达的方法,获得ARF18过表达胚乳。RNA-Seq以及GO功能富集分析显示,121个上调表达基因主要为激素响应、细胞壁疏松和水运输基因。以上表明,miR167通过调控靶基因ARF9和ARF18参与玉米胚乳发育调控。本研究通过组织细胞学与分子生物学技术,探讨了miR167对拟南芥花药开裂的影响与调控机制,为揭示miR167在玉米花药发育中的调控机理奠定基础;同时初步探究了miR167在玉米胚乳发育过程中调控路径,为进一步开展miR167对玉米胚乳发育的影响与调控机理提供理论依据。miR167在花药和胚乳中调控机理的揭示,为今后玉米雄性不育材料的创造及杂种优势育种、高产育种提供理论基础。