目的:本实验采用刚地弓形虫RH强毒株速殖子感染BALB/c雄性小鼠,建立雄性生殖毒性的小鼠模型,采用RNA原位杂交法检测虫体能否侵入小鼠睾丸及附睾;利用透射电镜观察弓形虫感染后小鼠睾丸组织超微结构的改变;采用单细胞凝胶电泳检测弓形虫感染是否导致小鼠睾丸细胞DNA损伤;采用分光光度法检测弓形虫感染对小鼠血清及睾丸组织氧自由基水平的影响,探讨弓形虫致小鼠睾丸细胞损伤的作用。方法:1.将20只BALB/c雄性小鼠随机分为感染组(16只)和正常对照组(4只),其中感染组小鼠腹腔注射弓形虫速殖子2.5×103个/0.2 ml/只,正常对照组腹腔注射无菌PBS(0.01 mol/L, pH=7.4)0.2ml/只,于攻虫第1,3,5,7天分别处死感染组小鼠4只和正常对照组1只,取睾丸及附睾,4 %多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片(7μm),采用RNA原位杂交法检测虫体能否侵入小鼠睾丸及附睾组织。2.将10只BALB/c雄性小鼠随机分2组,每组5只。正常对照组腹腔注射无菌PBS 0.2 ml/只;感染组腹腔注射纯化的弓形虫速殖子2.5×103个/0.2 ml/只。感染7天后处死各组小鼠,取睾丸组织1mm3 ,2. 5 %的戊二醛固定,切片,应用透射电镜观察睾丸组织超微结构的改变。3.将20只BALB/c雄性小鼠随机分4组(C、G1～3),每组5只。C组为正常对照组,腹腔注射无菌PBS 0.2 ml/只; G1～G3组为感染组,腹腔注射纯化的弓形虫速殖子:G1组注射2.5×103个/0.2 ml/只,G2组注射5×103个/0.2 ml/只,G3组注射1×104个/0.2 ml/只。感染7天后处死各组小鼠,将睾丸匀浆为细胞悬液,采用单细胞凝胶电泳检测睾丸细胞内DNA的损伤情况。4.将25只BALB/c雄性小鼠随机分为感染组(20只)和正常对照组(5只),正常对照组腹腔注射无菌PBS 0.2 ml/只;感染组腹腔注射弓形虫速殖子2.5×103个/0.2 ml/只。于攻虫第1,3,5,7天分别摘眼球取血、离心收集血清,用于测定小鼠血清氧自由基;分别取睾丸,匀浆、离心,取上清测定睾丸组织氧自由基水平。结果:1.RNA原位杂交于感染后第3天在小鼠睾丸及附睾内检测到弓形虫速殖子;感染后第5天和7天睾丸组织内弓形虫速殖子明显增多,且有假包囊形成。虫体主要位于生精小管的生精上皮内(精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞),虫体多侵入生精细胞的胞质内,少数侵入胞核内,睾丸间质细胞和支持细胞中也有虫体侵入。在附睾管壁上皮细胞和管腔内的精液中检测到虫体。统计分析显示,睾丸及附睾内的弓形虫数目随着感染时间的延长而明显增加,不同感染时间点同一组织内速殖子的数目差别具有统计学意义(P<0.01),而在同一感染时间睾丸及附睾内的弓形虫数目差别无统计学意义(P>0.05)。2.睾丸组织超微结构的改变:感染组小鼠睾丸精原细胞层变薄,精子数减少;生精细胞线粒体、内质网、溶酶体等细胞器的数量减少,有的生精细胞中染色质溶解,细胞器消失,并可见畸形精子;支持细胞间隙增宽,有的细胞核浓缩,精母细胞与支持细胞分界处的细胞器减少、空泡化,间隙增大。3.单细胞凝胶电泳发现感染组小鼠的睾丸细胞有彗星图像形成,彗星图像分析显示各感染组与阴性对照组的尾矩和Olive尾矩相比较有统计学意义(P<0.01),且随着攻虫数量的增加尾矩和Olive尾矩值也相应增加。4.弓形虫感染BALB/c小鼠可导致小鼠血清及睾丸局部的氧自由基(NO,·OH,O2-)水平升高,且血清和睾丸的氧自由基水平同步升高;血清和睾丸中的超氧化物歧化酶水平先升高而后降低。结论:1.刚地弓形虫可以侵入睾丸及附睾组织内。2.刚地弓形虫的侵入可导致睾丸组织超微结构发生改变。3.刚地弓形虫感染BALB/c小鼠可导致小鼠睾丸细胞DNA的损伤。4.刚地弓形虫感染BALB/c小鼠可导致小鼠血清及睾丸氧自由基(NO,·OH,O2-)水平升高。