研究背景:动脉粥样硬化(AS)是老年2型糖尿病(T2DM)患者最常见的血管并发症,糖尿病认知功能障碍是T2DM患者重要的神经系统并发症。T2DM患者的AS与认知功能状态之间是否存在关联呢?既往的研究发现AS与糖尿病存在共同的调控机制--巨噬细胞自噬。于是我们提出了两个假设:(1)老年糖尿病人的AS与非脑血管意外性的认知功能障碍之间存在一定的关系。(2)存在共同的途径调控巨噬细胞自噬来影响AS和糖尿病脑病(DE)的发生和发展。为了进一步验证我们的假设,我们设计以下临床及基础研究。第一部分动脉粥样硬化与老年2型糖尿病人的认知功能状态目的:本研究拟通过无创的AS检测,包括ba PWV,ABI,AIP,AASI以及c IMT来研究非脑血管意外的T2DM患者的AS程度与认知功能状态的关系,并探讨这些AS检测方法在DM中应用价值。方法:选取120例老年DM患者作为实验组(DM组)和100例非DM老人作为对照组(NDM组);用无创动脉硬化检测指标(ba PWV、ABI、AIP、AASI、c IMT)检测两组AS情况;同时比较两组的总体认知评估(MMSE、Moc A、ADL)和各认知域评估(记忆功能、执行功能评价、视空间能力、语言功能评价、注意力功能)。然后在DM组中,进一步通过Spearman相关分析评价AS与总体认知功能和各认知域的关系。结果:1.两组ba PWV、AASI、AIP各指标差异无统计学意义(P>0.05),DM组的ABI低于非DM组,DM组的c IMT高于非DM组,两者之间的差异有统计学意义(P<0.05)。2.与非DM病人相比,DM的总体认知功能有所下降,MOCA的得分降低,差异有统计学意义(p<0.05),日常生活能力两组没有区别。在认知域方面,与非DM病人相比,DM患者的记忆功能、语言功能较差,差异有统计学意义(p<0.05),3.在DM组中,ABI与总体认知功能的MMSE、MOCA之间呈正相关(r=0.626,r=0.628,P<0.05),与ADL之间呈负相关(r=-0.540,P<0.05);c IMT与MMSE、MOCA之间呈负相关(r=-0.387,r=-0.455,P<0.05),ADL之间呈正相关(r=0.238,P<0.05)。4.在DM组中,ABI与记忆功能、执行功能、语言功能之间呈正相关(r=0.547,r=0.627,r=0.482,P<0.05);c IMT与记忆功能、执行功能、语言功能之间呈负相关(r=-0.365,r=-0.280,r=-0.361,P<0.05)。而与视空间、注意力功能之间没有相关性。结论:ABI和cIMT检测AS严重程度更适于在老年T2DM患者中应用。DM组的总体认知功能差于非DM组,以记忆功能、语言功能减退为主。在语言功能检测中,WHO-BCAI VFT量表的敏感性较好。DM组的AS与总体认知功能状态之间有明显的相关性,尤其在记忆功能、执行功能、语言功能方面相关性最明显,ABI检测结果的相关性强于c IMT。第二部分miR-384-5p调控的巨噬细胞自噬在动脉粥样硬化发生发展中的作用目的:探讨miR-384-5p调控的巨噬细胞自噬在AS发生发展中的作用及机制。方法:10周龄雄性ApoE(-/-)小鼠20只,随机分为正常饮食组(NOR)、和高脂饮食组(HFD),每组10只,HFD组予以12周的高脂饮食(HFD)干预,成功诱导出了AS模型;将动物处死提取主动脉干,组织进行HE染色、免疫组化;流式细胞仪分选巨噬细胞,RT-PCR法检测各组细胞外基质的m RNA水平,Western blot法检测LC3-II/I、ATG7、p62、Beclin-1。miR-384-5p mimics、as-miR-384-5p、null controls转染巨噬细胞,通过生物信息学分析和双荧光素酶检测miR-384-5p的表达。结果:与NOR组小鼠相比,HFD组小鼠巨噬细胞自噬水平与NOR组相比在一定程度上受到了抑制;NOR组巨噬细胞Beclin-1的含量显著高于HFD组巨噬细胞Beclin-1的含量,RT-q PCR显示NOR组巨噬细胞Beclin-1 m RNA明显高于HFD组巨噬细胞Beclin-1 m RNA的含量,差异有统计学意义(p<0.05);Beclin-1可以与miR-384-5p的一段序列结合,与对照组比较,HFD组中小鼠巨噬细胞miR-384-5p的表达水平显著上升,差异有统计学意义(p<0.05)。荧光素酶报告显示Beclin-1 3’UTR荧光质粒转染的miR-384-5p巨噬细胞荧光活性与null组相比,巨噬细胞荧光活性显著降低,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:HFD诱导下细胞内miR-384-5p的表达增加,抑制了Beclin-1蛋白质的转录翻译过程,使Beclin-1蛋白质合成减少,导致巨噬细胞的自噬活性降低,同时HFD引起了巨噬细胞的凋亡,促进泡沫细胞形成,导致AS的发生。第三部分miR-384-5p调控的巨噬细胞自噬在糖尿病脑病发生发展中的作用目的:探讨miR-384-5p调控的巨噬细胞自噬在DE发生发展中的作用。方法:10周龄的雄性C57BL/6小鼠40只,随机分为生理盐水空白对照组(CTL)(10只)、和糖尿病脑病组(STZ)(30只),STZ组接受1%链脲佐菌素(150mg/kg)腹腔注射建立DE模型,同时STZ组中10只小鼠尾静脉注射腺相关病毒(AAV-null)(STZ+AAV-null组),10只接受AAV-miR-384-5p(STZ+AAV-miR-384-5p组)。水迷宫试验检验小鼠学习记忆能力的变化。提取脑组织,流式细胞仪分选巨噬细胞,Western blot法检测LC3-II/I、ATG7、p62。RT-PCR法检测Beclin-1m RNA水平,用免疫组化检测小鼠胰腺组织β细胞的数量,并检测小鼠脑组织丙二醛(MDA)、过氧化氢酶、超氧化酶阳性细胞和一氧化氮(NO)含量的变化。荧光素酶检测miR-384-5p表达的巨噬细胞的活性。结果:1.相对于CTL组小鼠,STZ组小鼠自噬相关蛋白Beclin-1表达增强(p<0.05),巨噬细胞自噬活性增强;2.miR-384-5p为Beclin-1靶向m RNA,能够抑制Beclin-1的表达;3.STZ组小鼠血清中的血糖、胰岛素的含量仅与是否接受STZ注射有关,与是否接受AAV转染无明显关系。AAV转染、miR-384-5p再表达对STZ糖尿病小鼠建模不产生影响;4.miR-384-5p的再表达可显著减少小鼠脑组织中的巨噬细胞含量;5.miR-384-5p通过抑制巨噬细胞自噬活性,进而导致脑组织降解标志物MDA,过氧化氢酶以及超氧化酶阳性细胞含量增高,NO水平减少。结论:STZ组小鼠Beclin-1表达增强是通过抑制miR-384-5p转录实现的。Beclin-1表达水平的增提示巨噬细胞自噬活性明显增高,出现脑功能损伤。STZ小鼠体内再表达miR-384-5p后,小鼠脑组织中的巨噬细胞自噬活性被明显抑制,STZ小鼠脑功能有一定程度的改善。