论文部分内容阅读
SARS冠状病毒引起的严重呼吸系统综合症,具有很高的传染性和致死率,目前尚无特异性预防及治疗药物,研究抗SARS病毒人源抗体被动免疫,将有助于对SARS病人的救治。 目前噬菌体抗体库技术已成为人源抗体制备的强有力工具,它易于操作,筛选容量大,有利于获得一些稀有抗体,并可直接获得完全人源的单克隆抗体。本研究工作可分为4个部分:抗体库的构建、抗体库的富集及特异性单克隆抗体的筛选、中和抗体MlA的可溶性表达及纯化、MlA抗体活性的定量分析。 一、噬菌体抗体库的构建 建立人抗SARS病毒Fab抗体基因库的淋巴细胞来源于恢复期SARS患者的外周血,免疫荧光及体外中和试验检测抗SARS病毒抗体的滴度≥1:256及1:64,这为建立可能筛选出高亲和力的抗体基因库创造了条件。提取淋巴细胞RNA,利用RT-PCR方法克隆出7条重链Fd段抗体基因和9条轻链抗体基因,依次将轻链基因混合物和重链基因混合物酶切后连入载体pComb3内,构建成人源Fab分子噬菌体表面呈现文库,库容约2×10~6。 二、抗体库的富集及特异性单克隆抗体的筛选 目前大量研究结果表明,SARS病毒的4个主要结构蛋白中,S蛋白的主要功能是通过特异受体介导病毒与靶细胞结合,引起细胞融合,它是宿主免疫应答的重要靶位。从抗体库中筛选抗SARS病毒中和抗体,以S蛋白作为筛选靶标,对抗体库进行了富集筛选,经过4轮的“吸附结合-洗脱-扩增”过程,富集了抗S蛋白噬菌体抗体库。 人源单克隆抗体的筛选分为两个过程,结合特异性和中和活性的筛选。首先确立了可靠的双抗体夹心ELISA方法检测抗S蛋白特异性抗体。从50株随机挑取的Fab抗体克隆中筛选出12株抗S蛋白特异性抗体,然后测定其对SARS病毒的中和活性,筛选到一株抗体,有明显的抗SARS病毒中和活性,可推迟细胞病变的发生,编号为MlA;基因测序分析表明MlA抗体的轻链为V_k 3a家族基因,重链为V_H3家族基因。