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一、甲基莲心碱增加K562/G01细胞的化疗敏感性研究。
目的：研究甲基莲心碱(Nef)对K562/G01细胞mdr-l mRNA、P-gP蛋白表达及K562/G01细胞内药物浓度的影响。
方法：采用细胞生物学方法(改良四氮唑盐MTT法)检测细胞毒性；高效液相色谱(HPLC)法测定K562/G01细胞内药物浓度；采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR法)和蛋白免疫印迹(Western-blot法)检测Nef对mdr-l mRNA及P-gp蛋白表达的影响。
结果：(1)Nef16、32、64μmol·L-1对K562/G01细胞及K562细胞均有抑制细胞增殖的作用，随着剂量的增加，作用也增强。Nef4μmol·L-1、Nef8μmol·L-1、维拉帕米(VRP)10μmol·L-1分别联合STI571处理K562/G01细胞后，均不同程度的降低了STI571对K562/G01的IC50，由原来的24.33±1.93μmol·L-1分别降至13.42±0.73μmol·L-1、10.15±1.27μmol.L-1、9.70±0.41μmol·L-1，逆转倍数分别为1.81、2.35、2.50，相对逆转率分别为45.9％、60.0％、61.5％，无毒剂量下Nef能增强STI571对K562/G01细胞的毒性作用，随着Nef剂量的增加，逆转作用也增加。(2)吸收1h和3h后，K562细胞内STI571含量分别为(1.807±0.189μmol·L-1和2.3490±0.074μmol·L-1)均高于K562/G01细胞内STI571含量(分别为0.1991±0.0193μmol·L-1和0.1987±0.0196μmol·L-1)(P<0.01)。吸收1h和3h后，分别经Nef、VRP处理组的K562/G01细胞内STI571含量均较未经药物处理组的K562/G01细胞内STI571含量高(P<0.01)。吸收1h后，Nef处理组的K562/G01细胞内STI571含量低于VRP处理组的K562/G01细胞内STI571含量(P<0.01)；吸收3h后，Nef处理组的K562/G01细胞内STI571含量略高于VRP处理组的K562/G01细胞内STI571含量，但无统计学差异(P>0.05)。(3)K562/G01细胞P-gP表达(0.5956±0.0185)较K562细胞P-gp表达(0.0285±0.0098)增高(P<0.01)；分别经Nef(8μmol·L-1)、VRP(10μmol·L-1)处理48h后K562/G01细胞P-gP表达均较未经药物处理组K562/G01细胞P-gp表达减低(P<0.01)；Nef8μmol·L-1处理48hK562/G01细胞P-gP表达分别较VRP10μmol·L-148h K562/G01细P-gP表达无统计学差异(P>0.05)。②K562/G01细胞mdr1基因表达(0.9783±0.0873)较K562细胞mdr-1基因表达(0.0191±0.0239)增高(P<0.01)；分别经Nef(8μmol·L-1)、VRP(10μmol·L-1)处理48h后，K562/G01细胞mdr-1基因表达均较未经药物处理组K562/G01细胞mdr-1基因表达减低(P<0.01)；Nef(8μmol·L-1)处理48h K562/G01细胞mdr-1基因表达分别较VRP(10μmol·L-1)48h K562/G01细胞mdr1基因表达无统计学差异(P>0.05)。
结论：Nef对K562/G01细胞及K562细胞均有抑制增殖的作用，且与剂量有关；在无毒剂量下，Nef能增强STI571对K562/G01细胞的毒性作用，增加K562/G01细胞内STI571的积聚浓度，下调K562/G01细胞mdr-1 mRNA表达水平，使mdr-1产物P-gp蛋白减少。
二.甲基莲心碱对K562/G01细胞增殖及p210bcr-abl的影响。
目的：研究Nef对K562/G01耐药细胞株bcr/abl融合基因及其融合蛋白表达的影响。方法：RT-PCR法和Western-blot法检测Nef对p210bcr-abl融合基因及融合蛋白表达的影响。
结果：(1)Nef2～64μmol/L对K562/G01细胞增殖均有抑制作用，STI571在K562细胞的IC50为0.634±0.04μmol/L，对K562/G01细胞的IC50为26.52±1.35μmol/L，K562细胞对STI571的耐药倍数是42.1倍。Nef4μmol/L、Nef8μmol/L与STI571(0.01～100μmol/L)联合用药组与STI571(0.01～100μmol/L)单独用药组相比均不同程度的降低了K562/G01细胞的IC50值，IC50由29.41±0.48μmol/L降至14.39±0.48、8.80±0.25和12.75±1.50μmol/L。(2)与STI57110μmol/L组相比，STI57110μmol/L联合Nef8μmol/L用药组p210bcr/abl融合基因和融合蛋白表达显著下降(p<0.05)。
结论：Nef对K562/G01细胞有抑制增殖作用，且随剂量增大而增强。在无毒剂量下，Nef能增强STI571对K562/G01细胞的毒性作用，下调K562/G01细胞bcr/abl mRNA及其p210bcr/abl融合蛋白表达水平。
三.甲基莲心碱对慢粒白血病细胞(CML)的p210bcr/abl和Jak-Stat信号通道基因表达的影响。
目的：研究甲基莲心碱对CML原代细胞p210bcr/abl融合基因、融合蛋白及其下游Jak-Stat信号通道基因的影响。
方法：采用细胞生物学方法(改良四氮唑盐MTT法)检测细胞毒性；采用RT-PCR法和Western-blotting法检测Nef对p210bcr-abl融合基因及融合蛋白表达的影响。荧光实时定量PCR real time(quantitative)PCR检测甲基莲心碱对CML细胞Jak-Stat信号通道基因。
结果：(1)Nef16、32、64μmol·L-1均对CML原代细胞有抑制细胞增殖的作用，随着浓度的增加作用增强(P<0.05)。Nef4μmol·L-1、Nef8μmol·L-1(均无明显毒性作用的浓度)各组药物联用STI571后均不同程度的降低CML原代细胞对STI571的IC50值，由原来的0.70±0.10μmol·L-1分别降至0.32±0.06和0.16±0.02，增敏倍数分别为原来的2.19和4.38倍。(2)经STI571和Nef联合处理的CML原代细胞p210bcr-abl融合基因(0.5700±0.1383)和融合蛋白(0.6319±0.0572)表达较单独使用STI571处理组(0.7111±0.1152)和(0.7824±0.0105)降低(P<0.05)；单独使用STI571(1μmol·L-1)处理的CML原代细胞p210bcr/abl融合基因表达(0.7111±0.1152)较未经药物处理组(0.9305±0.0241)降低(P<0.05)；STI571(1μmol·L-1)处理48h后，CML原代细胞Bcr-abl融合蛋白表达均较未经药物处理组降低(P<0.05)。(3)Nef联合STI571处理的CML原代细胞较单独使用STI571处理的CML原代细胞Stat5α mRNA表达降低(P<0.01)；单独使用Nef(8μmol·L-1)、Nef(4μmol·L-1)、STI571(1μmol·L-1)处理的CML原代细胞较未经药物处理组CML原代细胞Stat5α mRNA表达降低(P<0.01)。
结论：甲基莲心碱对CML原代细胞有抑制增殖的作用，且与剂量有关。Nef可增强STI571对CML原代细胞的增殖抑制作用及下调p210Bcr-abl捌融合基因及蛋白表达，降低Jak-Stat通路Stat5a基因的表达，提高CML细胞对STI571的敏感性。