论文部分内容阅读
大麦叶锈菌是一种分布广泛的作物病害，流行年份对大麦产量造成严重的损失，选育和栽培大麦抗性品种是目前防止该病害最经济有效的方法。植物的抗病性可分为质量抗性和数量抗性，质量抗性由单基因控制，对病原菌选择压力大，容易造成抗性丧失;而数量抗性由多个微效基因控制，表现为非小种专化性，抗性更持久。Rphq4是定位在大麦5H染色体上的数量抗性位点，通过基因组和转录组分析鉴定到两个候选基因，Rphq4-G1和Rphq4-G2，它们对表型变异的解释率达到44.7％。通过研究两个候选基因的功能，进而解析大麦抗叶锈病的分子机制，将为大麦抗性育种提供理论指导。 为了得到Rphq4-G1和Rphq4-G2的基因序列，通过二代和三代测序的数据，对Vada和SusPtrit的BAC重叠群进行了拼接，尤其是V50BAC(包含了Rphq4-G1和Rphq4-G2基因)，V50的BAC全长为130kb。应用RACE技术，克隆了Rphq4-G1和Rphq4-G2的全长cDNA序列，结果显示Rphq4-G1的cDNA全长是1683bp，其中包括127bp的5UTR、1323bp的编码序列和233bp的3UTR，且Rphq4-G1的编码序列比预测的多60个碱基;Rphq4-G2的cDNA全长是1682bp，包括142bp的5UTR、1458bp的编码序列和82bp的3UTR。 从1024株Vada的叠氮化钠突变群体中，筛选到1个Rphq4-G2的突变体M95，它是一个错义突变体（A366→T）。接种2000株的Vada M3植株，筛选到一个感病的突变体，测序发现Rphq4-G1的K39氨基酸突变为终止密码子(K39→stop)，是一个无义突变体。 利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术对Rphq4-G1、Rphq4-G2、Rphq4-G1+G2进行沉默。接种后发现，不论Rphq4-G1和Rphq4-G2单独被沉默，还是两个基因同时被沉默，都会导致Rphq4抗性的降低。亚细胞定位显示，Rphq4-G1和Rphq4-G2均定位于内质网。 构建Rphq4-G1、Rphq4-G2的过表达载体（Ubiquitin启动子，Hyg抗性）转化感病品种Golden Promise进行互补实验验证。Rphq4-G1和Rphq4-G2分别获得了27个和42个T0代阳性转基因植株;Rphq4-G1和Rphq4-G2“共转”获得了3个T0代阳性转基因植株，空载体对照获得10个转基因植株，转化率平均为2.5％。对T0代的转基因植株接种大麦叶锈菌后观察表型，发现转基因植株与空载体对照相比表型没有差异。构建Rphq4-G1、Rphq4-G2的CRISPR/Cas9载体，转化大麦抗病品种Vada没有获得转基因植株。 利用靶向代谢组学手段，对Vada和Vada-rphq4接种前后的细胞间隙液代谢物进行分析，发现接菌前后的代谢物不同，这些代谢物参与莽草酸途径，TCA循环等代谢过程。说明在代谢物水平上，多种途径共同参与大麦对叶锈菌的抗性反应。 以L94和Vada杂交获得的103份重组自交系群体为材料，定位与胚性愈伤形成(embryogenic callus generation)相关的QTL。结果显示，定位到2个控制胚性愈伤质量(embryogenic callus quality,ECQ)的QTL:Ecq1和Ecq2;定位到1个控制胚性愈伤形成比例(embryogenic callus generation ratio，ECGR)的QTL:Ecgr1;定位到1个控制胚性愈伤重量(embryogenic callus weight，ECW)的QTL:Ecw1。其中Ecq1、Ecgr1、Ecw1定位到3号染色体的分子标记E35M54-188和E40M32-410之间，对表型变异的解释率分别达到了26.5％、34.2％、19.8％。Ecq2定位到6号染色体上，对表型变异的解释率为8.0％。 综上所述，本研究发现两个候选基因Rphq4-G1和Rphq4-G2直接与植物的抗病相关。根据蛋白序列分析，推测其可能是一种新的抗病蛋白。