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鸡枞菌(Termitomyces spp.)作为珍贵的野生食用菌,其子实体的形成依赖“菌圃”,即蚁巢。菌圃是在白蚁的反复参与下,由其排泄物与鸡枞菌的孢子、菌丝以及环境相关微生物相互作用、协同发育而成的。当条件成熟时形成菌索,进而可以发育成鸡枞子实体。由这一过程可知,鸡枞菌与菌圃及其中的微生物形成了一种复杂的共生关系,也意味着共生的微生物对鸡枞菌的生长有至关重要的作用。本研究拟1)通过16S rDNA高通量测序分析菌圃及其近周土壤的宏基因组,明确菌圃中的群落结构及其与近周土壤微生物群落结构的差异,为相关的微生态研究提供背景支持;2)通过对菌圃微生物的分离、纯化,明确菌圃中可培养微生物的主体类群;3)分离、纯化并鉴定鸡枞纯种,考察鸡枞菌的生物学特性及功能,探讨鸡枞菌最优的离体纯种培养条件,尤其是液态培养条件,以获得大量菌丝体,进而为鸡枞菌的驯化及利用奠定基础。具体结果如下:(1)菌圃及其近周土壤中微生物的群落结构利用16S rDNA高通量测序技术对菌圃及其近周土壤微生物群落结构进行解析,α多样性指数显示,巢腔壁和菌圃中的细菌丰度和多样性均低于环境土壤。所有样本中,序列丰度大于1%的优势门有11个,为主体类群,占比约97%,包括变形杆菌(Proteobacteria)、放线菌(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯杆菌门(Chloroflexi)、拟杆菌(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、Latescibacteria、浮霉菌门(Planctomycetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)等。除厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌(Actinobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)外,其他8个门类的总丰度在样本中基本上按上述顺序依次递减。鸡枞生长的原位生态中,变形杆菌(Proteobacteria)为绝对优势门,尤其在菌圃和巢腔壁中相较环境土壤显著较高,其相对丰度分别为65.19%和70.11%。其下级分类水平α-Proteobacteria和β-Proteobacteria在菌圃和巢腔壁中的总丰度分别超过67%和56%,明显高于环境土壤(其中二者丰度分别为14.87%和6.94%左右)。并且α-Proteobacteria中的Bradyrhizobium仅在菌圃中呈高丰度,达24.82%,β-Proteobacteria中的Burkholderia-Para Burkholderia在巢腔壁和菌圃中含量均高于环境土壤,分别为43.89%和37.58%。其他的优势门类包括放线菌(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯杆菌门(Chloroflexi)和厚壁菌门(Firmicutes)等。放线菌(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯杆菌门(Chloroflexi)在环境土壤中的丰度无显著差异,但显著高于巢腔壁和菌圃,其在环境土壤、巢腔壁及菌圃中的相对丰度分别为18.18±1.48%、11.44%、5.45%,17.27±1.15%、4.88%、3.66%和14.77±1.91%、8.14%、6.02%。厚壁菌门(Firmicutes)作为优势门类之一,仅在菌圃中呈优势,其丰度为11.07%,并且以梭菌纲(Clostridia)最常见。环境土壤中丰度较高的OTUs有15个,以变形杆菌门和放线菌居多。巢腔壁中丰度较高的OTUs有22个,以变形杆菌居多,共计有15个OTUs,其中有9个OTUs为Burkholderia-Para Burkholderia属,放线菌次之有4个OTUs。菌圃中丰度较高的OTUs共计8个,2个OTUs来自绿弯菌门,3个OTUs来自变形杆菌门(Proteobacteria),分别为OTU2881(Bradyrhizobium属)和OTU2694(Burkholderia-Paraburkholderia属)。有2个OTUs来自厚壁菌门,分别是OTU2713(芽孢杆菌属Bacillus)和OTU2884(Lachnospiraceae科)。(2)鸡枞菌圃微生物的分离及初步鉴定本研究中试验菌株子实体及组织分离培养物分别经ITS测序分析,与核酸数据库比对后,确定其均为Termitomyces。对菌圃中其它可培养的微生物进行分离,共得到383株细菌和放线菌,其中339株为革兰氏阳性,44株为革兰氏阴性;得47种丝状真菌,根据菌株形态学特征能初步鉴定的有43株,其中木霉属(Trichoderma)17株,曲霉(Aspergillus)6株,炭角菌属(Xylaria)3株,青霉属(Penicillium)5株,交链孢霉属(Alternaria)3株,镰孢菌属(Fusarium)3株,链孢霉属(Streptomyces)1株,高山被孢霉(Alpina)1株,毛霉属(Mucoraceae)1株,截盘多孢属(Truncatells)1株,枝孢属(Clodosporium)1株,鸡枞菌(Termitomyces)1株;另有4株未鉴定。(3)鸡枞离体培养特征观察鸡枞菌丝体在固体培养条件下菌苔边缘菌丝发达,呈白色,菌苔中心凸起部位会分泌透明或黄色液滴,液滴中含大量椭圆的孢子,随着时间推移液滴逐渐胶质固化,胶质的部分以族生的椭圆分生孢子为主,然后发育成白色的菌丝,菌丝整体细长,横隔少,顶端呈圆杆状,最后菌丝逐渐黄化。液体培养条件下发酵前期(4d)的鸡枞菌球有毛刺,此时的菌丝粗大,横隔明显。发酵7d时,其菌球为紧密光滑的椭圆状,少分支,此时的菌丝细长,横隔较少。(4)鸡枞离体培养条件优化在固态培养条件下,采用单因素实验筛选对鸡枞菌丝生长影响较为显著的最适值,发现鸡枞菌菌丝生长最适碳源为葡萄糖,氮源为蛋白胨,硫酸镁2.0g/L,磷酸二氢钾2.5g/L,p H为4.0,培养温度28℃。以前三个因素影响较大,对它们进行组合实验,结果显示,以葡萄糖20g/L,蛋白胨2.0g/L,硫酸镁2.0g/L时鸡枞菌菌丝生长最好,为1.41mm.d-1。在液态培养条件下,采用单因素实验筛选对鸡枞菌丝生长影响较为显著的最适值,发现鸡枞菌菌丝生长最适碳源为葡萄糖,氮源为豆粕,硫酸镁1.0g/L,磷酸二氢钾1.0g/L,p H为6.0,培养温度28℃。以碳源、硫酸镁和p H三个因素影响较大,对它们进行组合实验。结果显示,以豆粕,硫酸镁1.5g/L,p H6.0时鸡枞菌菌丝生物量最高,为11.6g/L。