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纹枯病是世界各水稻产区广泛发生、危害严重的一种重要病害。其病原菌有性态为瓜亡革菌[Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk],无性态为立枯丝核菌[Rhizoctonia solani Kuhn]。该病菌可以侵染水稻、大豆、玉米、大麦、狗牙根和狗尾草等43科200多种植物,引起纹枯和立枯等症状。病菌与寄主互作过程中可分泌多种重要的细胞壁降解酶,并通过这些酶降解寄主细胞壁,从而达到侵入寄主的目的,多聚半乳糖醛酸酶则是其中最重要的一种胞壁降解酶。本研究以水稻纹枯病强致病菌株YN-7为研究对象,采用PCR及RT-PCR方法克隆了3个完整的多聚半乳糖醛酸酶基因。其中PG6934基因全长1633bp,包含6个内含子,其cDNA全长1311bp(KP896519),编码436个氨基酸,前16个氨基酸为信号肽序列；PG9039基因全长943bp,包含4个内含子,其cDNA全长720bp (KP896520),编码239个氨基酸；PG9605基因全长1466bp,包含8个内含子,其cDNA全长1038bp(KP896521),编码345个氨基酸。生物信息学分析表明,PG693^ PG9039和PG9605均含有PG特有的保守结构域NTD、DD、SHG和RIK。其中,PG6934的4个结构域位于225NTD、248DD、 270SHG 和310RIK; PG9039的4个结构域位于58NTD、80DD、101GHG和133RIK；而PG9605的4个结构域位于130ETD、153DD、175SHG和211RIK。PG6934的10个半胱氨酸残基形成5个二硫键；PG9039的4个半胱氨酸残基形成2个二硫键；而PG9605的8个半胱氨酸残基形成4个二硫键。三个PG的二级结构均以a-螺旋、p-折叠和卷曲为其基本结构单元,跨膜结构预测表明它们均以从胞内向胞外分泌为主。将3个多聚半乳糖醛酸酶基因分别连接到原核表达载体pET-28a,并转化至大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。结果表明,无论是上清还是经超声波破碎处理或反复冻融处理的菌体,均检测不到多聚半乳糖醛酸酶活性,包涵体变性复性后仍不具活性。将3个新基因和本实验室以前克隆得到的多聚半乳糖醛酸酶基因RsPGl (KP896518)分别构建到真核表达载体pPIC9K,转化受体毕赤酵母GS115,经甲醇诱导表达,上清均具有多聚半乳糖醛酸酶活性,工程菌GS-PG6934-7、GS-PG9039-5、GS-PG9605-8和GS-RsPG1-10酶活性最高,分别为101.21U/mL、91.09U/mL、91.09U/mL和267.21U/mL。采用针刺法将粗酶液接种至水稻叶鞘,48h后出现明显的坏死斑。用4种粗酶液处理四叶期水稻叶鞘,对水稻叶鞘均可产生浸解作用,处理24h后,还原糖量(OD540)分别为1.387、1.061、1.053和1.664,细胞损伤率分别为78.4%、62.6%、55.5%和90.0%。Real-time PCR分析表明,这几个基因在纹枯病菌侵染水稻过程中,均能上调表达,而且以接种后48h表达量最高,但不同基因之间表达量差异极显著,说明这些基因均参与了病原菌对寄主的致病过程,但各基因作用大小不同。