论文部分内容阅读
细胞色素P450酶(CYP450)是一种位于内质网膜上的以血红素为活性中心的酶蛋白超级家族,参与生物体内各种外源性和内源性物质的代谢过程。目前在人肝脏中发现了15种CYP450,CYP 2C9是最重要的CYP450亚型之一(约占总CYP蛋白量的20%)。由CYP450 2C9代谢的底物约占总CYP代谢药物的16%,包括阿米替林,氟西汀,氯沙坦,苯妥英和许多非甾体抗炎药。CYP450 2C9还催化人肝微粒体中内源性底物,如花生四烯酸和亚油酸环氧化酶的代谢。CYP450在溶液中的代谢均需要电子供体辅酶NADPH的参与,而NADPH价格昂贵且不易保存,这已成为限制药物体外代谢研究的一个因素。因此人们便尝试将CYP450固定在电极上,用电极替代NADPH为CYP450活性中心提供催化所需要的电子。但是,CYP450酶的活性中心被包埋在蛋白结构中,这使得它与电极之间的电子交换比较困难。因此,人们尝试使用各种纳米材料来加快两者之间的电子传递。在此研究中,我们构建了一种基于各碳纳米材料的第三代CYP2C9生物传感器,无需NAD(P)H或任何介体,可以实现CYP和修饰电极之间的直接电子转移(DET)。此外,我们还研究了CYP2C9对底物的代谢和药代动力学,并用简单廉价的传感体系评估了几类抑制剂对CYP2C9活性的影响。第一章:简单介绍了电化学传感器和CYP450的概念,综述了酶的固定化方法及酶传感器的各种应用。第二章:以SBA-15为模板,乙二胺为氮源,制备了氮掺杂的介孔碳(N-MC)。并以N-MC与纳米金(AuNPs)的复合材料(N-MC/AuNPs)为载体,把细胞色素P450 2C9酶(CYP2C9)成功地固定在了玻碳电极表面,构建了电化学驱动CYP2C9催化甲苯磺丁脲的体系。基于循环伏安法研究了CYP2C9与电极之间的电子传递机制,在扫速为0.02-0.5 V s-1时,其电子转移速率常数为0.26-5.35 s-1。利用安培法测得CYP2C9对甲苯磺丁脲催化的表观米氏常数为153.67μmol L-1。此外,CYP2C9的抑制剂氯霉素对甲苯磺丁脲的代谢过程有明显的抑制作用,其半数抑制浓度值(IC50)为0.515μM。同时,此复合材料导电性高、比表面积大以及良好的边缘效应,具有优异的直接电子转移和生物催化性能,为CYP2C9酶提供合适的微环境。表明了该体系有望成为电化学生物传感器的新平台。第三章:通过非共价修饰和氮原子掺杂方式对石墨烯进行改性,制备了阳离子聚丙烯酰胺功能化氮掺杂石墨烯(CPAM-NG),并将P450 2C9酶固定在滴有此材料的玻碳电极上,成功构建了电化学驱动CYP2C9催化甲苯磺丁脲代谢的传感体系。利用循环伏安法研究CYP2C9和电极之间的电子传递机制,其直接电子转移常数值为1.84 s-1,CYP2C9酶电极对甲苯磺丁脲有积极的电化学响应,表观米氏常数值为117.86μM。借助微分脉冲伏安法,进一步研究了五种抗抑郁药物对CYP2C9催化甲苯磺丁脲的抑制作用,计算出各半数抑制浓度,对研究药物相互作用及临床用药有一定的指示作用。第四章:通过强酸氧化的方式对多壁碳纳米管(MWCNTs)进行羧基化,制备了羧基化的多壁碳纳米管(COOH-MWCNTs)。把CYP2C9通过静电作用和共价键合方式固定在COOH-MWCNTs修饰的玻碳电极上,由于该材料具有导电性和生物兼容性良好、在溶液中分散性好的优点,所以成功构建了CYP2C9催化甲苯磺丁脲的电化学传感器。用循环伏安法(CV)研究了电极和CYP2C9之间的电子传递机制,计算得直接电子转移常数值为1.62 s-1。该传感器对底物甲苯磺丁脲有很好的响应,在0-256.3μmol L-1范围内呈线性关系,表观米氏常数为186.37μmol L-1。另外,通过微分脉冲伏安法(DPV)测定抑制剂氟康唑和西咪替丁对该过程的半数抑制浓度(IC50)分别为4.2和17.6μmol L-1,为CYP2C9的中度抑制剂和弱抑制剂。