角膜移植是对因圆锥角膜、角膜变性、角膜营养不良、角膜瘢痕及角膜炎症等疾病导致角膜盲病人实行的一种复明手术。由于正常角膜不含血管和淋巴管,处于相对的免疫“赦免”区,因而角膜移植术后的免疫排斥反应发生率较低;但对于高危角膜(角膜新生血管,炎症等)来说,因其免疫“赦免”状态被破坏,术后排斥发生率较高。虽然角膜移植是最为成功的器官移植手术之一,但术后排斥反应仍是手术失败的最主要原因。角膜移植免疫排斥反应是一个相当复杂的免疫反应过程,其具体发病机制仍不明确。研究表明细胞因子在角膜移植免疫中起着重要作用。辅助性T淋巴细胞(helper T lymphocytes,Th)是产生细胞因子种类最多的细胞,也是免疫调节的核心细胞,其核心作用主要是通过复杂的细胞因子调节网络实现的,因而其与角膜移植免疫的发生密切相关。根据产生细胞因子的种类不同,Th细胞被分类为Th1细胞和Th2细胞。Th1细胞主要产生包括IFN-γ、IL-2等Th1型细胞因子,主要介导细胞免疫包括迟发型超敏反应和细胞毒性T淋巴细胞反应;Th2细胞主要产生IL-4、IL-10等Th2型细胞因子,主要活化B细胞产生抗体,介导体液免疫;Th1因子和Th2因子相互作用,互相制约。研究表明,角膜移植免疫排斥反应是主要由Th1细胞介导的迟发型超敏反应。但也有研究认为,Th2因子亦与移植排斥反应有关,应用Th2因子抑制剂可延长移植器官的存活。因此进一步深入研究各种细胞因子在角膜移植免疫中的相互作用及其在排斥反应发生前后的表达情况不仅为阐明角膜移植排斥反应机理提供理论基础,还有助于临床尽早发现排斥反应,以便早期干预,降低角膜移植排斥反应的发生率。CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cells,CD4+CD25+Tr)细胞具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特性,在预防自身免疫性疾病及调节移植耐受方面具有重要的作用。FOXP3是表达于CD4+CD25+Tr的胞内分子,大量实验证实,FOXP3对于CD4+CD25+Tr细胞的发育及功能的维持具有重要的作用,是其转录因子和重要的分子标志,给CD4+CD25-T细胞转入FOXP3可使其具有CD4+CD25+Tr的免疫抑制功能。因此研究FOXP3在角膜移植免疫排斥反应中的作用具有重要的意义,对于了解效应性T细胞(effector T cell,Teff)与CD4+CD25+Tr在角膜移植免疫排斥反应中的关系具有很大帮助。CD25,IL-2受体的α链,不仅是效应性T细胞的标志,而且是CD4+CD25+Tr细胞重要的表面标志。在CD4+CD25+Tr高表达CD25,有助于发挥调节性T细胞的免疫抑制功能;而在效应性T细胞高表达CD25,T细胞增殖,导致排斥反应的发生。当前用于防治角膜移植排斥反应的免疫抑制药物包括糖皮质激素及环孢素等,然而长期应用这些药物会产生严重的并发症,包括感染,白内障,青光眼及肾毒性。因而开发高效低毒的新的免疫抑制治疗药物对防治角膜移植排斥反应具有重要意义。CD25单克隆抗体在对肾脏移植后免疫排斥反应的防治中发挥了有效的作用,但其应用于防治角膜移植免疫排斥反应的报道比较少见。CD25单克隆抗体通过特异结合CD25抑制CD25的功能,因而其对效应性T细胞和CD4+CD25+Tr功能的发挥都有一定的影响。本课题为更好地分析研究CD25单克隆抗体在防治角膜移植免疫排斥反应中对二者的影响,确定其对角膜移植免疫排斥反应的防治效果,首先从Th1/Th2角度(主要因子IFN-γ/IL-4)来分析研究Th细胞在角膜移植免疫反应中的作用;同时通过对CD4+CD25+Tr转录因子FOXP3的表达的研究,探讨CD4+CD25+Tr在角膜移植免疫反应中的作用。最后我们通过构建FOXP3真核表达载体,为进一步通过转基因治疗角膜移植免疫排斥反应奠定实验基础。根据以上所述,本课题拟进行如下研究:(1)研究效应性Th1/Th2因子(IFN-γ/IL-4)在角膜移植免疫排斥反应中的作用。(2)研究CD4+CD25+Tr(FOXP3)在角膜移植免疫排斥反应中的作用。(3)探讨应用CD25单克隆抗体/及联合糖皮质激素在防治角膜移植免疫排斥反应中对效应性Th1/Th2因子(IFN-γ/IL-4)的影响。(4)探讨应用CD25单克隆抗体/及联合糖皮质激素在防治角膜移植免疫排斥反应中对CD4+CD25+Tr(FOXP3)的影响。(5)探讨应用CD25单克隆抗体及联合糖皮质激素对角膜移植免疫排斥反应的防治效果和安全性。(6)构建大鼠FOXP3真核表达载体,为进一步通过转基因治疗角膜移植免疫排斥反应的研究提供实验基础。本课题的研究主要分为以下4部分:第一部分IFN-γ,IL-4与CD25在角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究目的探讨IFN-γ、IL-4与CD25在角膜移植免疫排斥反应中的作用。方法以Wistar大鼠为供体,SD大鼠为受体建立角膜移植实验模型。将57只SD大鼠随机分为3组,A组为正常组(9只),B组(24只)和C组(24只)为Wistar-SD大鼠之间进行同种异体角膜移植组。术后分别球结膜下注射给药,B组给予生理盐水;C组给予地塞米松,100ug/次。各共用5次,分别于术后0、2、4、6、8天给药。用裂隙灯显微镜观察角膜移植排斥情况,逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测植片内IFN-γ、CD25 mRNA的表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测房水和血清中IFN-γ和IL-4的含量,流式细胞术(FCM)检测移植术前和术后不同时间外周血淋巴细胞CD3+CD25+T的表达。术后11天,对各组角膜植片进行免疫组织化学检测CD4、CD8和CD25的表达。结果C组发生排斥反应时间(16.417±1.379)天较B组发生排斥反应时间(10.583±1.084)天明显延迟,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。正常角膜无IFN-γ、CD25 mRNA的表达,B组移植术后第11天角膜植片内IFN-γ、CD25mRNA的表达较C组明显增强(P＜0.05)。B组:移植术后第6天即见血清IFN-γ浓度升高明显,第11天IFN-γ的水平达高峰(13.307±2.540)pg/ml,第24天时IFN-γ水平明显下降。与正常SD大鼠及移植术后6天SD大鼠血清IFN-γ相比,移植术后11天SD大鼠血清IFN-γ明显增高,差异具有统计学意义(P＜0.05)。血清IL-4的浓度在移植前后无明显变化。移植术后第6天见房水IFN-γ及IL-4浓度均有升高,第11天时,IFN-γ的水平达高峰(155.947±23.807)pg/ml,而IL-4的浓度增高不显著,第24天时IFN-γ及IL-4水平明显下降。角膜移植术后CD3+CD25+T/CD3+T的表达在第6天(6.593±0.365)%及11天(8.607±1.241)%明显高于术前(P＜0.05)。术后11天,免疫组织化学检查发现角膜植片中CD4、CD8和CD25表达明显。C组:与B组相比,在角膜移植排斥反应期间,C组中IFN-γ、IL-4和CD3+CD25+T/CD3+T的表达明显减弱。结论CD25、IFN-γ和IL-4在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用;促进IL-4的表达,抑制IFN-γ及CD25的产生,对降低角膜移植免疫排斥反应具有积极的作用;术后动态检测外周血CD25和IFN-γ的表达有助于临床了解局部免疫反应的程度并预测角膜移植排斥反应的发生。第二部分FOXP3在角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究目的探讨FOXP3在角膜移植免疫排斥反应中的作用。方法以Wistar大鼠为供体,SD大鼠为受体建立角膜移植实验模型。将57只SD大鼠随机分为3组,A组为正常组(9只),B组(24只)和C组(24只)为Wistar-SD大鼠之间进行同种异体角膜移植组。术后分别球结膜下注射给药,B组给予生理盐水;C组给予地塞米松,100ug/次。各共用5次,分别于术后0、2、4、6、8天给药。用裂隙灯显微镜观察角膜移植排斥情况,RT-PCR方法检测植片内FOXP3 mRNA的表达,FCM术检测移植术前和术后不同时间外周血淋巴细胞CD4+CD25+T及CD4+FOXP3+T的表达。术后11天,对各组角膜植片进行免疫组织化学检查CD4、CD8、CD25和FOXP3的表达。结果C组发生排斥反应时间(16.417±1.379)天较B组发生排斥反应时间(10.583±1.084)天明显延迟,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。正常角膜无FOXP3 mRNA的表达,B组移植术后第11天角膜植片内FOXP3 mRNA的表达较C组明显减弱(P＜0.05)。B组:角膜移植术后CD4+CD25+T/CD4+T的表达在第11天(7.337±0.634)%明显高于术前(P＜0.05)。而角膜移植术后CD4+FOXP3+T/CD4+T的表达在第11天(2.803±0.255)%明显低于术前(P＜0.05)。术后11天,免疫组织化学检查发现角膜植片中CD4、CD8和CD25表达明显,FOXP3有一定的表达。C组:与对照组相比,在发生角膜移植排斥反应期间,地塞米松治疗组中FOXP3和CD4+FOXP3+T/CD4+T的表达明显增强,CD4+CD25+T/CD4+T的表达明显减弱。结论FOXP3在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用;增强植片内FOXP3的表达和/或增加外周血CD4+CD25+Tr的含量有助于抑制角膜移植免疫排斥反应的发生。第三部分CD25单克隆抗体防治大鼠角膜移植免疫排斥反应的实验研究目的研究CD25单克隆抗体对角膜的毒性以及对效应性T细胞和调节性T细胞的影响,探讨其对大鼠角膜移植免疫排斥反应的防治效果。方法1.将12只SD大鼠随机分为生理盐水对照组、50ug CD25单克隆抗体结膜下注射组、100ug CD25单克隆抗体结膜下注射组、200ug CD25单克隆抗体结膜下注射组,每组3只。各组大鼠均右眼用药,分别于0、2、4、6、8天结膜下注射生理盐水及不同剂量的CD25单克隆抗体,共5次。每日行裂隙灯显微镜检查,观察角膜有无水肿、混浊发生,并于第9天取右眼角膜行病理及透射电镜观察角膜各层的变化。2.以Wistar大鼠为供体,SD大鼠为受体建立角膜移植实验模型。将93只SD大鼠随机分为五组,A组:正常组(9只);B组:角膜移植对照组(24只);C组:CD25单克隆抗体治疗组(18只);D组:CD25单克隆抗体联合地塞米松治疗组(18只);E组:地塞米松治疗组(24只)。B组:术后给予生理盐水;C组:术后给予CD25单克隆抗体100ug;D组:术后给予CD25单克隆抗体100ug联合地塞米松50ug治疗;E组:术后给予地塞米松100ug。各共用5次,分别于术后0、2、4、6、8天经球结膜下注射给药。用裂隙灯显微镜观察角膜移植排斥情况,RT-PCR法检测植片内IFN-γ、CD25和FOXP3 mRNA的表达,ELISA法检测房水中IFN-γ和IL-4的含量,FCM术检测移植术前和术后不同时间外周血淋巴细胞CD4+CD25+T及CD4+FOXP3+T的表达。结果1.50ug CD25单克隆抗体和100ug CD25单克隆抗体对角膜基本无毒性影响;200ug的CD25单克隆抗体组透射电镜检查发现角膜基质细胞及内皮细胞有不同程度的肿胀。2.C、D、E组发生排斥反应时间(分别为13.167±1.169,17.333±2.160,16.417±1.379)天较B组发生排斥反应时间(10.583±1.084)天明显延迟,差异有统计学意义(P＜0.05)。正常角膜无IFN-γ、CD25和FOXP3 mRNA的表达,术后第11天,B组移植角膜植片内IFN-γ、CD25 mRNA的表达较C、D、E组明显增强(P＜0.05),C组FOXP3 mRNA的表达较D、E组明显减弱(P＜0.05)。C、D、E组术后6天及11天房水IFN-γ的含量明显低于同期B组(P＜0.05);同C组相比,术后11天D、E组房水IFN-γ的含量明显降低(P＜0.05)。术后6天和11天,与B组相比,同期C组IL-4含量明显升高(P＜0.05),而同期D、E组IL-4含量明显降低(P＜0.05);术后6天和11天,与C组相比,同期D、E组IL-4含量明显降低(P＜0.05)。术后11天,与B组相比,C、D、E组外周血CD4+CD25+T/CD4+T的表达明显降低(P＜0.05),与D、E组相比,C组外周血CD4+CD25+T/CD4+T的表达明显降低(P＜0.05)。术后11天,与B组相比,C组外周血CD4+FOXP3+T/CD4+T的表达差异无统计学意义(P＞0.05),而D、E组外周血CD4+FOXP3+T/CD4+T的表达明显升高(P＜0.05),与D、E组相比,C组外周血CD4+FOXP3+T/CD4+T的表达明显降低(P＜0.05)。结论1.50ug CD25单克隆抗体和100ug CD25单克隆抗体对角膜基本无毒性影响。2.效应性T细胞和调节性T细胞在角膜移植免疫排斥反应过程中均发挥重要的作用,抑制效应性T细胞、促进调节性T细胞的表达对防治角膜移植免疫排斥反应具有重要意义;CD25单克隆抗体在抑制效应性T细胞的同时,也抑制了调节性T细胞的功能;而CD25单克隆抗体联合小剂量地塞米松在抑制效应性T细胞的同时,又相对促进了调节性T细胞的表达,对防治角膜移植免疫排斥反应具有重要的临床应用价值。第四部分大鼠FOXP3基因的克隆及真核表达载体的构建目的构建大鼠FOXP3真核表达载体,为转基因治疗角膜移植免疫排斥反应提供实验基础。方法采用RT-PCR技术从SD大鼠脾脏扩增FOXP3基因,EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切pcDNA3.1载体和FOXP3,DNA连接酶连接,构建pcDNA3.1-FOXP3真核表达载体,测序鉴定。结果从大鼠脾细胞中成功克隆获得了1290bp的FOXP3基因,测序结果表明正确构建了含有FOXP3基因的pcDNA3.1-FOXP3真核表达载体。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-FOXP3,为进一步研究其对角膜移植免疫排斥反应的影响奠定了基础。全文结论1.IFN-γ、IL-4及CD25在角膜移植免疫反应的调节中发挥着重要的作用;检测外周血IFN-γ及CD25的表达可成为临床尽早诊治角膜移植排斥反应发生的重要手段;运用一定的方法,促进IL-4的表达,抑制IFN-γ及CD25的产生,对降低角膜移植免疫排斥反应具有积极的作用。2.FOXP3在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用;增强植片内FOXP3的表达和/或增加外周血CD4+CD25+Tr的含量有助于抑制角膜移植免疫排斥反应的发生。3.眼局部应用治疗剂量的CD25单克隆抗体(100ug内)对角膜基本无毒性影响。4.降低Th1因子(IFN-γ)、促进Th2因子(IL-4)的表达对抑制角膜移植免疫排斥反应的发生有一定的作用;但同时抑制Th1因子(IFN-γ)、Th2因子(IL-4)的表达,却更能有效的抑制角膜移植免疫排斥反应的发生,更有利于角膜植片的存活。5.效应性T细胞和调节性T细胞在角膜移植免疫排斥反应过程中均发挥重要的作用,抑制效应性T细胞,促进调节性T细胞表达对防治角膜移植免疫排斥反应具有重要意义;CD25单克隆抗体在抑制了效应性T细胞同时,也抑制了调节性T细胞功能的发挥;CD25单克隆抗体联合小剂量地塞米松抑制效应性T细胞功能的同时,相对促进了调节性T细胞的表达,对防治角膜移植免疫排斥反应具有重要的临床应用价值。6.成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-FOXP3,为进一步通过局部或全身转染FOXP3基因,研究其对角膜移植免疫排斥反应的影响奠定了基础。