论文部分内容阅读
提高猪肉产量是生猪产业重要的育种目标之一。猪肉主要由肌肉、肌间脂肪、血管、结缔组织等构成,其中肌肉为最主要部分。按照结构和功能,肌肉分为平滑肌、心肌和骨骼肌。骨骼肌分布于躯干和四肢,是最主要的肌肉组成。明确骨骼肌生长发育的分子机制有利于提高猪肉产量。猪骨骼肌的发生过程主要分为肌纤维数量的增加和肌细胞体积增大两个过程,按肌纤维类型大致分为3个生长峰:初级纤维大约在妊娠35天-55天形成,为次级纤维的生长提供依附支架;次级纤维形成于妊娠55天-90天;妊娠90天肌纤维数量基本稳定,肌纤维成熟,体积增大。已有的研究主要针对基因的表达和miRNA等方面解析猪骨骼肌生长发育调控机理,但近来有报道提示组蛋白H3K27甲基化参与了骨骼肌发育的过程,但其调控机制尚不明晰。因此,本研究通过染色质免疫共沉淀-测序技术(ChIP-Seq)检测组蛋白H3K27me3对背最长肌全基因组的修饰模型,重点关注骨骼肌次级纤维的形成过程,采集杜洛克胚胎65和90天背最长肌,采用western blotting技术检测组蛋白H3K27me3在这两个发育节点的表达,确认H3K27me3参与了次级纤维的形成;进一步通过ChIP-Seq检测组蛋白H3K27me3对这两个时间节点的被最长肌调控的基因组序列,并通过RNA测序技术(RNA-seq)检测这两个发育节点的转录情况,获得骨骼肌发育的转录谱,将两个结果联合分析,筛选肌肉发育过程中受组蛋白H3K27me3调控的DNA元件和关键基因。具体结果如下:(1)western blotting技术检测H3K27me3在杜洛克胚胎65和90天背最长肌中表达,且在65天组织中的组蛋白修饰水平显著低于90天,提示其在骨骼肌次级纤维形成的过程中可能发挥重要作用。(2)ChIP-Seq技术结果表明H3K27me3修饰的65天个体背最长肌特异结合峰有4987个,在90天个体背最长肌特异结合峰有9424个;对猪胎儿骨骼肌差异峰结合位点(cell component,CC)的GO分析发现,大部分的修饰基因具有细胞、细胞组成成分、核糖体、核糖核蛋白复合体、细胞内非胞膜细胞器等细胞组分信号;而这些修饰基因主要进行的分子功能有:结合作用、组蛋白结合、离子结合、有机环状化合物结合、杂环化合物结合等)等过程的峰差异基因数。峰差异基因KEGG富集分析结果显示:多数基因在参与甲状腺癌、矿物质的吸收、癌症通路、前列腺癌、Rap1信号通路、含血清素的神经突触等多条代谢通路。(3)RNA-seq技术结果显示在65天个体中表达差异基因数有10947个,90天个体中表达差异基因数有11404个,不同时期的试验组的共有差异基因有10294个。GO功能富集结果显示:猪胎儿骨骼肌中参与无机阳离子跨膜转运活性、离子通道活动、门控通道活动、钙调素结合、金属离子跨膜转运活性、呼吸链、氧化还原酶、细胞外间质、线粒体内膜、细胞表面、突触调节组织、调节突触结构和活动、神经系统发育调节、突触结构、调节神经元分化等生物过程。KEGG富集结果显示:猪胎儿骨骼肌中参与的帕金森氏症、氧化磷酸化作用、产热作用、阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈病、非酒精性脂肪肝、细胞表面粘附分子、PPAR信号通路、Rap1信号通路、胆固醇代谢、心肌收缩、流体剪切应力和动脉粥样硬化、丙酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等疾病或代谢通路过程。(4)ChIP-seq与RNA-seq联合分析,结果显示两个试验组间受H3K27me3修饰的差异基因数为209个。GO功能富集分析结果显示这些差异基因主要参与胞质膜组织、细胞粘附、蛋白结合、磷酸化调节、RNA聚合酶激活、钙离子代谢、生殖细胞发育等生物过程。KEGG通路富集分析结果显示这些差异基因主要参与类固醇生物合成、丙酮酸代谢、氨基酸代谢,糖酵解、磷酸戊糖途径、RNA聚合酶激活等生物信号通路过程。(5)进一步我们分析了在65天背最长肌中H3K27me3富集水平较低且表达量高的基因,共有112个,其中75个已被注释,37个为新基因,进一步筛选已被注释且表达差异倍数大于2的基因(log2foldchange>1)共55个。我们选取了5个基因:EPHA7、GRID2、GRIP1、KCNC2、RAB25进行ChIP-qPCR和RT-qPCR检验。ChIP-qPCR验证结果表明:EPHA7、GRID2、GRIP1、KCNC2、RAB25在不同时期骨骼肌中受组蛋白H3K27me3调控的相关基因在90天富集量均显著高于65天,定量结果与测序结果一致。RNA-seq结果表明这些基因在90天猪胎儿骨骼肌中的相关基因表达量显著低于65天,与测序结果一致。本研究结果不仅可从理论上初步阐明组蛋白H3K27甲基化对猪骨骼肌发育的调控作用,也将为猪产肉性状的分子改良提供新思路。