肠道缺血再灌注损伤作为一种高并发症和死亡率的临床事件,早在60年前就引起了许多学者的关注。肠道局部的缺血再灌注损伤,可以导致全身炎症反应及远隔器官功能障碍已在大量实验研究及临床观察中得到证实,但是其作用机制至今未明。继倍受争议的肠道细菌-内毒素易位学说后,Schmid-Schonbein GW提出了肠道自身消化学说,他们认为胰蛋白酶在炎症和多器官功能障碍进程中起着非常关键的作用。当机体遭受感染、创伤、休克等打击时,肠腔中的胰蛋白酶可以透过缺血的肠道粘膜屏障进入粘膜下层基质中引起肠道组织自身消化并介导生成大量炎症介质。因此,通过抑制缺血肠道中的蛋白酶活性,可能对控制炎症和休克的进展有关键作用。乌司他丁(UTI)是从人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂,对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶及粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶、纤溶酶等多种酶有抑制作用。静脉注射乌司他丁的抗炎作用已经在肠道缺血再灌注损伤、感染性休克及失血性休克等休克模型中得到证实,并被认为其抗炎作用有可能与其具有稳定溶酶体膜,抑制溶酶体酶的释放,抑制心肌抑制因子(MDF)产生,清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用有关。根据自身消化理论,我们认为乌司他丁的抗炎作用有可能与其最重要的功能——抑制胰蛋白酶活性有关。本实验旨在验证自身消化假说及探讨乌司他丁抗炎作用的机制。1、材料和方法1.1动物及分组48只健康清洁级雄性WISTAR大鼠(由南方医科大学动物实验中心提供),体重200-250g,术前禁食禁水8小时。随机分成四组,A组：对照组(sham group);B组：肠道缺血再灌注但不灌洗肠道组(SMAO group);C组：肠道缺血再灌注,用生理盐水灌洗肠道组(SMAO+NS group);D：肠道缺血再灌注,用乌司他丁灌洗肠道组(SMAO+UTIgroup).每组12只,各组大鼠体重无明显差异。1.2实验程序秤取健康WISTAR大鼠体重,以3%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉成功后,将大鼠仰卧位固定于实验手术板(37℃-38℃)上,于左侧腹股沟处备皮消毒,行左侧股动脉、股静脉游离术。游离好动静脉后,以PE50动脉置管分别行动、静脉穿刺术置管术,股动脉套管经三通阀与动脉套装相连,然后连接于血压监护仪,监测平均动脉压变化。股静脉套管与三通阀和2ml注射器相连,用于静脉补液。置管术完成后,于上腹部正中备皮、消毒,打开腹腔,分离肠系膜上动脉,在动脉根部环绕一根丝线(3-0),丝线两头均穿过一个约1cm长的软管管芯,通过拉紧丝线阻断肠系膜上动脉血流制作肠道缺血再灌注损伤模型。分别于十二指肠上端及回肠末端插入软管用丝线结扎,形成循环通路,用于肠道灌洗。A组动物只进行手术操作；B组、C组和D组,通过阻断肠系膜上动脉血流造成肠道缺血100分钟后恢复动脉血流；C组和D组分别于缺血前(40m1),再灌注后20分钟及60分钟(30m1)时用含或者不含UTI(100U/ml)的盐水缓慢灌洗肠道。各组随机取6只大鼠进行生存时间观察,在再灌注后80min拔除动脉及肠道插管,小心结扎漏口及缝合伤口,观察其生存时间。各组其余6只大鼠收集标本进行检测,收集C组和D组第二次及第三次肠道灌洗液,取其中5ml离心(500g×5min),取上层清液2ml于-70℃保存以备检测蛋白酶活性。再灌注后80分钟,抽取动脉血2ml(抽血后经静脉补充等量生理盐水),含肝素10U/ml,其中1ml用于检测白细胞表面CD11b表达水平,另外1ml离心(500g×5min)后,取血浆于-70℃保存以备检测肿瘤坏死因子α及白介素1水平。在再灌注后80min处死大鼠,收集小肠组织进行组织病理检测。1.3指标检测1.3.1肠道缺血再灌注过程中平均动脉压(MAP)变化通过彩色插件式监护仪(美国惠普医疗器械公司,型号M1166A64S)观察并记录大鼠肠道缺血再灌注过程中MAP的变化。1.3.2生存时间当大鼠心脏停止跳动,未经处理5min没有变化,确定为死亡。1.3.3白细胞表面粘附分子CD11b表达水平试管编号,加入所需荧光标记单抗CD11b-FITC(英国SEROTEC公司产品),同时加一管Mouse IgGl-FITC作为同型对照；每管加入标本106个细胞,暗处,室温(10-25℃)放15分钟；加入溶血液2ml,暗处放10分钟；离心1000转/5分钟,去上悬液,加入PBS2ml混匀；离心1000转/5分钟,去上清,加0.5ml1%甲醛固定液,待上FACSCato II型流式细胞仪检测,用FACS DIVA软件分析报告,数据用百分数表示。1.3.4肿瘤坏死因子a及白介素1水平检测使用R&D公司提供的大鼠TNF-a和IL-1试剂盒,采用酶联免疫吸附法(ELISA法)测定血浆TNF-a和IL-1水平。剂盒中使用纯化抗体包被在微孔板内使其充分吸附在微孔壁上制成固相载体。试验过程中标准品、酶标记物和待测样品共同竞争包被在微孔上的固相抗体的定量结合位点。通过温育反应使其充分结合在微孔壁上形成标记复合物。反应过后冲洗掉未结合的部分再加入底物反应底物在酶的作用下变为蓝色并在酸的作用下转化为最终的黄色。通过使用酶标仪读取吸光度值来绘制出标准曲线并在标准曲线上反算出待测样品的浓度。1.3.5肠液蛋白酶活性检测用Enz-Chek Protease Assay Kits依据其说明书检测肠液蛋白酶活性。将试剂盒中提供的纯蛋白酶配成不同浓度梯度的溶液并检测其活性以制备标准曲线,将20“l样本与80μ1X消化液及100μl含蛋白底物的工作液放入96孔板中置于37℃培养箱避光孵育60min,孵育后用酶标仪检测荧光活性。根据标准曲线将荧光活性(FU)转换成蛋白酶浓度(μg/ml).1.3.6肠道组织病理切片处死大树后后在距屈氏韧带5cm处取空肠组织4cm,用0.9%NaCl和0.25%枸橼酸钠溶液反复冲洗各4次,取中间2cm组织4%甲醛固定,经脱水、浸蜡、包埋、切片、染色后制成病理切片,光学显微镜下观察。1.4统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行处理,计量资料均以χ±SD表示,大鼠平均动脉压采用重复测量数据的方差分析；大鼠生存时间、中性粒细胞CD11b的表达、TNF-a及IL-1水平的比较均采用完全随机设计多样本比较的方差分析,采用LSD法进行多重比较；肠道蛋白酶活性的比较用两样本T检验；P<0.05为差异有统计学意义。2、结果2.1生存时间分析假手术组大鼠生存时间均大于24小时,MSAO组大鼠平均生存时间为0.48小时,与SMAO+NS组(2.1小时)及SMAO+UTI组(6.4小时)相比明显缩短(P<0.05).SMAO+UTI组生存时间明显长于SMAO+NS组(P<0.01).2.2肠道缺血再灌注过程中血压变化情况阻断肠系膜上动脉血流时,各组大鼠血压均立即明显升高(约20-28mmHg),再灌注后血压均立即显著下降(约40～58mmHg). SMAO组在灌注后血压下降最明显,再灌注后第一个时间点血压明显低于其他三组,之后血压持续性下降,SMAO+NS组与SMAO+UTI组的低血压均有一定程度的缓解。SMAO+UTI组血压在再灌注30分钟后各个时间点血压均明显高于SMAO+NS组。2.3中性粒细胞表面粘附分子CDllb (PMN CDllb)的表达炎症反应早期,中性粒细胞表面粘附分子CD11b表达增加,以介导中性粒细胞的粘附和聚集。因此我们测定PMN CDllb的表达水平以反应炎症反应水平。SMAO+NS组的PMNCDllb的表达水平明显高于SMAO+UTI组(P<0.05)。表明肠道灌注乌司他丁可以在炎症的早期降低炎症反应水平。2.4TNF-α和IL-1水平TNF-a和IL-1是白细胞被激活后释放的主要促炎因子。SMAO+UTI组TNF-a和IL-1水平明显低于SMAO+NS组(P<0.05)。2.5肠道蛋白酶活性用等量的生理盐水灌洗肠道,乌司他丁使SMAO+UTI组肠液中蛋白酶活性(16S.09±16.22μg/ml)明显降低,与SMAO+NS组(282.85±13.90μg/ml)比较有显著性差异(P<0.05)。2.6肠道组织病理变化肉眼观察MSAO组大鼠小肠大部分缺血坏死,呈暗红色；SMAO+NS组片状坏死；SMAO+UTI组点状坏死,大部分为粉红色正常组织。光镜下观察SMAO+NS组组绒毛断裂,坏死,大量炎性细胞浸润。SMAO+UTI组与对照组比较也表现为炎性细胞浸润,程度较SMAO+NS组轻,未见绒毛断裂现象。3.结论1、肠道内灌注乌司他丁可以延缓肠缺血再灌注损伤大鼠休克后血压下降过程,最终延长存活时间。2、乌司他丁作为蛋白酶抑制剂,通过肠道内灌注后,可以降低肠缺血再灌注损伤大鼠休克后血浆炎症反应水平,明显降低PMN CDllb.肿瘤坏死因子α和白细胞介素1水平。3、通过肠道灌洗和肠道内灌注乌司他丁,可以降低肠道内的蛋白酶含量,减缓蛋白酶对肠道组织的自身消化作用,从而对肠道黏膜具有一定保护作用,减轻休克时肠道黏膜的损害。