论文部分内容阅读
2,3-丁二醇是具有广泛用途的大宗化学品,在油墨、香水、炸药、塑料、食品、药品生产方面有重要应用。目前2,3-丁二醇的生产主要来自石油,生物炼制可以使该产品的生产摆脱对原油的依赖。在中国大力发展低碳经济和谋求可持续发展的今天,开发基于可再生生物质原料生产2,3-丁二醇的研究引起广泛的重视。洋姜是一种可再生的廉价生物质资源,广泛应用于乙醇、乳酸等大宗化学品的发酵法生产过程中,而其在生物法生产2,3-丁二醇的应用较少,主要菌株包括Klebsella pneumoniae和Bacillus polymyxa,其中前者是条件致病菌,而后者产量较低,同时菊粉酶价格昂贵,限制了菊粉原料在2,3-丁二醇的生物法生产中的应用。本研究内容针对菊粉生产2,3-丁二醇过程中存在的主要问题,从高温生物安全菌株筛选、菊粉酶的克隆表达、同步糖化发酵等几个方面对利用菊粉质原料生物法生产2,3-丁二醇进行了较为系统的研究。具体内容如下:首先从嗜热Bacillus licheniformis10-1-A中扩增出果聚糖酶基因并在大肠杆菌中进行了表达;进一步优化了诱导条件,发现在20℃条件下0.6mMIPTG加量进行诱导表达12 h得到较高的表达量;开发了果聚糖酶快速纯化工艺,结合50℃温育、镍柱和分子筛对该酶进行纯化,得到果聚糖酶,其纯化收率为60%,纯化倍数为30倍,纯酶的比酶活为981.6 U/mg;利用纯化酶对该酶水解菊粉的最佳作用条件及稳定性进行研究,结果表明该酶最适作用pH为6.5,最适温度为60℃。同时该酶在pH 5～11,温度55℃以下能够保持较好稳定性。以上结果表明该酶比较适用于高温同步糖化发酵生产2,3-丁二醇。对比了实验室现存五株B.licheniformis发酵果糖生产2,3-丁二醇的能力。摇瓶实验结果表明B.licheniformisDSM13较其他的菌株具有生产优势;同时优化了同步糖化过程中的加酶量,结果表明加酶量在30 U/g底物时即可满足发酵需要;进一步在摇瓶中对比同步糖化发酵和分步糖化发酵策略结果表明同步糖化发酵不但操作简单,而且可以提高菌株的生长速率和目的产物的生产速率,后续实验采用同步糖化发酵方法进行生产。5 L发酵罐中的补料同步糖化发酵30 h,2,3-丁二醇产量为103 g/L,乙偶姻为3.7 g/L发酵过程生产强度为3.4 g/Lh。30 h后2,3-丁二醇浓度开始下降,逐渐转化为乙偶姻;该产量和生产强度为利用菊粉质原料生产2,3-丁二醇的最优成果。为进一步简化发酵操作过程,降低生产成本,后续实验中尝试利用Pseudomonas syringae中的冰核蛋白在大肠杆菌中进行菊粉酶的细胞表面展示,以达到进一步简化同步糖化发酵菊粉质原料生产2,3-丁二醇的目的。本研究选取了B.polym xa中菊粉酶和和地衣芽孢杆菌中的果聚糖酶,利用引物重组PCR方法人工合成冰核蛋白CN端序列,并分别连接到两种菊粉酶的N端进行表达。在大肠杆菌中经过IPTG诱导表达后进行全细胞催化实验。当两种重组菌体OD620nm=15时,酶活分别为0.6 U/ml和1.0 U/ml,初步实现了其在大肠杆菌中的表面展示。