第一部分小鼠卵母细胞体外成熟前老化的染色体及线粒体分布变化研究背景近年来,临床生殖医学技术得到了飞速的发展,为无数不孕不育夫妻解决了生育小孩的问题。而由于工作压力及生活等各种因素,许多妇女常常只能大龄生育。然而,在绝经期来临之前,女性生殖力明显呈现出与年龄相关的下降趋势。随着年龄的增长,尤其是超过35岁,卵子数量和卵母细胞的质量逐渐下降,从而导致越来越多不孕的问题。因此,卵母细胞衰老的问题受到越来多的关注。由于胚胎细胞质几乎直接来源于卵母细胞,因此卵母细胞的质量直接影响胚胎的后续发育能力。在辅助生殖技术(ART)中,患者进行控制性促排卵(COH)治疗时,由于临床上促排卵方案种类繁多,需要根据患者个体化进行选择,因此每个患者在HCG刺激排卵前所用的促排卵的方案及所用时间各有不同。然而,当不同卵母细胞在不同卵泡中刺激发育时并不完全是同步的,有些卵子在卵泡中发育得比较快,而有些卵子发育得较慢,这些不同步发育的卵子在HCG同一时间进行刺激排卵时,就会出现较早开始发育的卵子就有可能在HCG排出前在GV期就老化了,而有些卵子仍然处于年轻的阶段。我们把这种在促性腺激素刺激排卵前卵子在GV期就发生老化的过程称为“卵子成熟前老化”。这种情况在ART的患者中很常见,也会在高龄妇女或PCOS患者中常常发生,这也可能是这些患者卵子质量低下胚胎发育不良的原因之一。同时,这也可能是ART中患者取出的卵子数量很多,而最后形成正常胚胎进行移植的数量很少的原因之一,因为未成熟的卵子在成熟前就发生老化,会改变卵子的受精结局,非整倍体或染色体异常经常被认为是导致卵子不能受精或受精后形成染色体异常的胚胎,从而导致移植失败的重要原因之一。而线粒体作为细胞中的主要产能场所,其分布及功能的变化也会极大的影响着细胞内各种生理活动的正常运转。很少有人在这些成熟前就发生老化的未成熟的卵子上面进行研究,老化的卵子的染色体情况及其线粒体分布的变化目前仍然未知。了解成熟前老化的GV卵子的染色体结构及线粒体分布的变化为有利于阐明成熟前老化卵母细胞的低发育潜能和高损失率的机制,同时为在临床上提高老化卵子的质量提供新的思路。研究目的在本研究中我们通过体外小鼠未成熟卵母细胞用IBMX使其在GV期分别停止发育12小时、24小时和36小时,模拟体内卵子不同时间段成熟前老化的状态,随后进行进一步体外成熟,检查其染色体是否异常及成熟前老化的GV期卵子的染色体和线粒体分布情况与成熟率是否相关,为了解老化卵子低成熟率和胚胎低发育率的机制有重要的作用,同时为提高卵子质量提供理论依据和提供新策略。研究方法1.体外培养体系中加入3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX),对小鼠未成熟卵子进行体外老化及体外成熟处理。拾获的小鼠未成熟卵母细胞分为四组:1)成熟前老化0小时组(0hrs);2)成熟前老化12小时组(12hrs);3)成熟前老化24小时组(24hrs组);4)成熟前老化36小时组(36hrs组);5)体内成熟的小鼠卵母细胞1.1实验小鼠进行PMSG促卵母细胞发育,体内成熟的卵子HCG促排卵。1.2 GV期未成熟卵母细胞和MII期成熟卵母细胞的收集。1.3三组卵母细胞分别体外成熟前老化12小时、24小时和36小时,0小时组直接体外成熟。1.4三组卵母细胞成熟前老化后移除IBMX,进行体外成熟培养。2.对新鲜体内成熟卵母细胞和不同老化时间的小鼠卵母细胞进行成熟率和染色体、线粒体的检查。2.1 GVBD率和MII率。计算每个组核膜破裂消失(GVBD)的卵子数量和第一极体卵子吐出(MII)成熟阶段的卵子数量。2.2 MII期卵母细胞染色体检查体内成熟的新鲜卵子及不同时期体外老化的卵子每组随机挑选10枚进行单细胞全基因组扩增和染色体CNV检查。2.3线粒体活动分布。Mitotracker Red CMXRos对GV期卵母细胞进行线粒体分布检查。研究结果1.小鼠未成熟卵子体外老化后卵子成熟率下降。2.体外成熟前老化时间延长,染色体异常数量增多。3.卵母细胞成熟前老化时间越长,线粒体异常分布增高。研究结论1、新鲜体内/体内成熟的卵子染色体大多数正常,体外成熟前老化的卵母细胞在体外老化时间越长,其染色体异常的卵子数量明显增多,同时出现非整倍体的几率也随之升高。2、成熟前老化越严重,其线粒体活力下降,染色体异常率升高,从而影响卵母细胞进一步成熟及发育的能力,这很可能是衰老卵子其胚胎形成率及发育能力低下的重要原因。第二部分重金属耦合剂和抗氧化剂在小鼠卵母细胞体外成熟前老化中的保护作用研究背景不孕症近年在人群中是一个很大的健康问题。随着女性生育年龄的增高,越来越多的夫妇需要依靠辅助生殖技术(ART)获得怀孕,因此辅助生殖技术是不孕患者取得怀孕的希望。就目前而言,随着女性生育年龄不断推迟,导致卵子老化的问题日益严重,同时也为辅助生殖技术提出更高要求。毫无疑问,健康的卵子是成功受精,胚胎移植和后续移植后成功种植的重要保证。然而,在ART中,患者进行控制性促排卵治疗时,当不同卵母细胞在不同卵泡中发育时并不全是同步的,当有些卵子在卵泡中发育得较其他卵子快时,这些卵子在HCG刺激卵子排卵时,这些较早发育的卵子就有可能在HCG排出前在GV期就老化了,我们把这种在促性腺激素刺激排卵前卵子就发生老化的过程称为“卵子成熟前老化”。这种情况在辅助生殖技术中很常见,这也可能是这些患者卵子质量低下胚胎发育不良的原因之一。未成熟卵子在其成熟前就发生老化会改变卵子的受精结局。在影响辅助生殖技术的各种不利因素中,氧化应激(OS)被认为是影响卵母细胞发育和成熟的重要因素之一。氧化应激来源于活性氧(ROS)与生物抗氧化剂之间的平衡被打破,造成活性氧浓度增高,而高浓度活性氧会破坏细胞内的正常生命活动,造成细胞DNA损伤,使细胞内蛋白质和脂类改变,细胞器结构及功能受损,最终导致细胞死亡。人类在许多不同生殖状态下都存在氧化应激状态,尤其是在进行辅助生殖技术(ART)过程中,体外操作不能完全模拟真实的体内生理条件,多种因素都可能导致氧化应激的产生和增加,当其作用于精子、卵子及胚胎等,影响胚胎着床,从而影响ART治疗的结局。同时,有研究发现重金属也可以使卵子内氧化应激水平升高从而影响卵子发育能力。目前来说,很多研究都发现重金属耦合剂或抗氧化剂在卵子和胚胎发育有利于卵母细胞/胚胎的发育,基本都是从单一种类的重金属耦合剂或抗氧化剂来说明问题,但很少研究会涉及单一药物或/和混合药物添加对成熟前老化卵子的影响。而且,目前,几乎所有研究都关注卵母细胞减数分裂后的状态,很少报道其对卵母细胞成熟前老化的影响,也没有研究重金属耦合剂和抗氧化剂对GV期成熟前老化的卵母细胞的发育潜能和质量是否有影响。在人类辅助生殖技术中GV卵子成熟前老化发生在卵子没有及时在适当时间刺激成熟,卵子质量就会下降,在重金属耦合剂和抗氧化剂对成熟前老化的卵母细胞的保护作用目前仍然未知。因此,在本研究中,小鼠卵子用IBMX模拟人类辅助生殖技术控制性促排卵中卵子成熟前老化,并用不同药物培养不同的时间段,然后卵子进行IVM评估重金属耦合剂和抗氧化剂在小鼠卵子细胞器中的作用。我们的研究中,GV期的小鼠卵子在含有IBMX的培养液中培养可以避免发生减数分裂,从而让卵子维持在GV期,而添加重金属耦合剂(EDTA),抗氧化剂(柠檬酸钠、硫辛酸(ALA)和乙酰肉碱(ALCAR)),分别体外成熟前老化12小时、24小时和36小时,然后再把卵子体外成熟培养(IVM)。IVM后,卵子通过生发泡破裂(GVBD)、减数分裂、线粒体活动分布、纺锤体组装和DNA碎片(DSBs)等指标检测来评估体外成熟前老化卵子的细胞质量,为探索人类ART周期中成熟前老化卵母细胞的低发育潜能和高损失率的机制提供新的思路,同时为治疗ART中由于卵子老化引起的胚胎发育不良等后果提供理论依据。研究目的因此,在本研究中,小鼠未成熟卵母细胞用IBMX使其在GV期分别停止发育12小时、24小时和36小时,模拟体内卵子成熟前老化状态,体外培养过程中通过培养液中添加重金属耦合剂EDTA和抗氧化剂柠檬酸钠、硫辛酸ALA和乙酰肉碱ALCAR,然后对体外老化的卵母细胞进行体外成熟培养,老化后的成熟卵母细胞通过GVBD率、MII率、线粒体活动分布、纺锤体组装等指标检测来评估体外成熟前老化卵子的细胞质量,未能成熟的GV期卵母细胞进行DNA碎片(DSBs)检查,从而评估重金属耦合剂和抗氧化剂对体外老化的小鼠卵母细胞是否有保护卵子免受氧化应激损伤,提高卵子受精发育能力的作用,在防止卵子老化和为高龄妇女等患者提供辅助生殖策略等方面均有重要的意义。研究方法1.体外培养体系中加入重金属耦合剂和抗氧化剂,对小鼠未成熟卵子进行体外老化及体外成熟处理。拾获的小鼠未成熟卵母细胞分为五组:1)重金属耦合剂组(MC);2)抗氧化剂组(AO组);3)重金属耦合剂和抗氧化剂组(MC+AO组);4)对照组(Control组)。5)新鲜组1.1实验小鼠进行PMSG促排卵。1.2 GV期未成熟卵母细胞的收集。1.3新鲜组卵母细胞直接体外成熟培养。1.4实验组和对照组卵母细胞分别体外成熟前老化12小时、24小时和36小时。1.5实验组和对照组卵母细胞成熟前老化后移除IBMX,进行体外成熟培养。2.对新鲜组卵母细胞和不同老化时间的小鼠卵母细胞进行成熟率和其他能量代谢指标检查。2.1 GVBD率和MII率。计算每个组核膜破裂消失(GVBD)的卵子数量和第一极体卵子吐出(MII)成熟阶段的卵子数量。2.2线粒体活动分布。Mitotracker Red CMXRos线粒体分布检查2.3纺锤体形态及染色体排列。采用免疫荧光细胞化学法进行纺锤体和染色体检查。2.4卵母细胞DNA损伤DSBs。GV期停滞卵母细胞用DNA损伤探针γ-H2AX抗体进行DSBs检查。研究结果1.重金属耦合剂和抗氧化剂提高老化卵子成熟率小鼠未成熟卵子经过体外成熟前老化12小时、24小时和36小时后再进行IVM,14-16小时后计算其GVBD率和MII成熟率。当卵子经过成熟前老化12小时后,GVBD率和MII成熟率在四个组中没有统计学差异。当成熟前老化延长至24小时和36小时,卵子在重金属耦合剂和抗氧化剂处理组和对照组在GVBD率中仍然没有差异。随着体外老化培养的时间延长,所有组中的卵母细胞的成熟率都有明显下降,然而,在24小时和36小时中在重金属耦合剂和/或抗氧化剂组中卵母细胞达到MII期的比率明显比对照组高(P<0.05)。2.重金属耦合剂和抗氧化剂在线粒体分布中的作用和延迟线粒体凋亡。线粒体分布及其功能对卵子成熟和进一步发育有着重要影响。异常线粒体活性成簇状/团装分布,我们的结果显示,30.6%-47.5%的卵母细胞在12小时成熟前老化后呈现异常线粒体分布模式,而各组之间没有统计学差异。当卵母细胞经过24小时-36小时成熟前老化后,我们再检测其线粒体分布情况,重金属耦合剂和/或抗氧化剂组中卵母细胞的异常线粒体分布明显低于对照组。当成熟前老化时间从12小时延长到36小时,卵母细胞异常线粒体分布在所有组中都有升高(P<0.05)。3.EDTA、柠檬酸钠、ALA和ALCAR维持老化卵子的正常纺锤体形态和染色体排列卵子质量同样取决于正常纺锤体形态和染色体排列。异常纺锤体/和染色体排列的比例在对照组明显高于重金属耦合剂和/或抗氧化剂处理组,重金属耦合剂组卵母细胞的异常纺锤体/和染色体排列比率在12-36小时成熟前老化中都比对照组低(P<0.05),抗氧化剂组和混合组在12小时和24小时成熟前老化中跟对照组没有出现差异,只有在36小时成熟前老化中才出现统计学差异(P<0.05)。4.重金属耦合剂和抗氧化剂可以降低DNA损伤形成ROS和抗氧化剂的不平衡可以导致不同形式的DNA损伤,DSBs是最严重的DNA损伤表现之一,严重威胁卵子的活力甚至生命。我们发现,12小时成熟前老化中,DSBs平均荧光强度在抗氧化剂组明显低于其他组,但其他组没有差异,当成熟前老化延长至24小时,抗氧化剂组和混合组仍然维持低水平。24-36小时成熟前老化后混合组同样显示低水平。结果提示重金属耦合剂和抗氧化剂对于ROS形成的DNA损伤在长时间体外培养有保护作用,但抗氧化剂硫辛酸和乙酰肉碱比重金属耦合剂的保护作用更强大。总的来说,我们发现,重金属耦合剂和抗氧化剂在提高成熟率、保护线粒体功能、纺锤体形态和DNA组装方面可以有明显抗氧化作用,从而保护卵子免受OS损伤。当体外老化时间延长到12-36小时,重金属耦合剂和抗氧化剂的保护作用愈加明显。线粒体功能损伤、异常纺锤体和DNA损伤可能与老化卵子的低发育率有关系。因此,沃恩的研究建议,重金属耦合剂和抗氧化剂可以添加到培养液中以保护卵子免受氧化应激损伤。研究结论1、体外成熟前老化的卵母细胞在体外培养过程中其线粒体功能损伤、异常纺锤体发生和DNA损伤可能与老化卵子的低发育率有关系。2、随着体外成熟前老化培养时间延长,卵母细胞在成熟率、正常线粒体和纺锤体分布排列、DSBs方面明显下降。3、在体外培养中添加重金属耦合剂EDTA和抗氧化剂柠檬酸钠、硫辛酸和乙酰肉碱后能延缓卵子老化的时间,保护卵子免受氧化应激损伤。4、抗氧化剂对体外成熟前老化的卵母细胞因氧化应激造成DNA损伤有较明显的保护作用。