背景帕金森病(Parkison’s disease, PD)的发病机制尚不完全清楚,目前认为与遗传因素和环境因素及其相互作用有关。表观遗传学为人们探索帕金森病的发病机制提供了新的思路。DNA甲基化是发现最早的、最基本的,也是研究最多的表观遗传学机制。DNA甲基化与疾病的关系已逐渐成为医学研究的新热点之一。DNA甲基化具有组织特异性,而中枢神经系统疾病取材脑组织的难度较大,且难以作为后续开展生物标记研究的依据。某些DNA甲基化改变在脑组织和外周血中具有一致性,在精神疾病和神经退行性疾病研究领域,利用外周血标本开展DNA甲基化的研究取得了一定进展。PD作为一种全身受累的疾病,外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)是研究PD患者多巴胺能神经元变性损伤的一种很好的外周模型。PD患者外周血中是否存在DNA总体甲基化水平、DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)及甲基化CpG结合蛋白(methyl binding protein, MBPs)的表达异常,目前国内外尚无研究。目的探讨散发PD患者PBMCs中是否存在DNA总体甲基化水平、DNMTs及MBPs表达水平的异常,并结合各临床参数探讨年龄、性别、药物使用对DNA总体甲基化水平、DNMTs及MBPs表达水平的影响。方法应用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技术对63例正常对照和62例散发PD患者PBMCs中DNA总体甲基化水平进行检测；应用实时荧光定量PCR进行DNMTs及MBPs的表达水平的检测；应用统计学方法对两组的测定值进行比较。结果1.散发PD患者PBMCs中DNA总体甲基化水平较正常对照降低(正常对照组10.33%±0.88%vs.PD组9.92%±0.98%,P<0.05);男性PD的DNA总体甲基化水平较男性对照显著降低(男性对照10.44%±0.89%vs.男性PD9.88%±0.88%,P<0.05),而女性PD和女性对照的总体甲基化水平无显著差异(P>0.05)。2.病程、年龄、发病年龄以及L-dopa使用对于本组实验对象DNA总体甲基化水平无显著影响(P>0.05)；3.与正常对照相比,散发PD患者PBMCs中DNMTs及MBPs的mRNA表达水平均显著增高(P<0.05)；4.在本组PD患者中PBMCs中：DNMT3A的mRNA表达水平和年龄呈负相关(rs=-0.294,P<0.05);MBD4的mRNA表达水平和年龄呈正相关(rs=0.238,P<0.05)；DNMT3A的mRNA表达水平在男性患者显著低于女性患者(男性PD0.59±0.26vs.女性PD0.83±0.34, P<0.05);MBD3的mRNA表达水平在使用L-dopa治疗的患者显著降低(NLOPD组1.21±0.34vs.LDPD组1.03±0.22,P<0.05)。5.在本组PD患者PBMCs中,DNA总体甲基化水平与DNMT1和MBD1的mRNA表达水平呈负相关(rs[DNMT1]=-0.497,P<0.05,rs[MBD1]=-0.265,P<0.05)。结论在国内外首次开展了散发PD患者PBMCs中DNA总体甲基化水平、DNMTs及MBPs表达水平的检测,散发性PD患者PBMCs中存在DNA总体甲基化水平、DNMTs及MBPs表达水平异常。年龄、性别、药物使用可影响PD患者的DNA甲基化状态。背景散发PD患者PBMCs中存在DNA甲基化异常,而PD主要病理改变主要位于中脑黑质,因此研究黑质部位的DNA甲基化具有重要意义。MPTP诱导的小鼠PD模型是研究PD发病机制、神经生化、病理解剖、运动及精神障碍、药物作用等方面的应用最广的动物模型。MPTP作为最早被发现的、最经典的可导致选择性黑质部位多巴胺能神经元变性损伤的环境因素,其毒性作用依赖N-甲基基团的存在。在PD患者和MPTP诱导的动物模型的黑质部位存在蛋白质和脂质的N-甲基化修饰异常,提示MPTP模型诱导的PD模型黑质部位可能存在DNA甲基化修饰异常。表达谱研究表明MPTP诱导的灵长类和啮齿类PD模型黑质部位基因的表达存在显著的改变,而DNA甲基化作为一种基因表达的重要调控机制,是否参与了PD动物模型黑质部位神经元变性损害和PD症状的发生目前尚不清楚。目的本研究拟用一种环境毒素MPTP诱导小鼠PD模型并对其评价。利用这种模型进行DNA甲基化研究,探讨MPTP诱导的小鼠PD模型黑质部位是否存在DNA甲基化异常,构建MPTP诱导的小鼠PD模型黑质部位DNA甲基化谱并寻找DNA甲基化修饰异常的PD相关基因。方法1.采用MPTP连续腹腔给药的方法建立MPTP诱导小鼠PD模型,进行行为学观察和分析,运用免疫组织化学染色和Western Blot(?)去检测TH表达水平。2.运用ELISA方法对MPTP诱导小鼠PD模型中脑黑质DNA总体甲基化水平进行检测。3.运用实时荧光定量PCR对MPTP诱导小鼠PD模型中脑黑质DNMTs和MBPs的mRNA表达水平进行检测。4.采用甲基化DNA免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP)技术结合Roche-NimbleGen全基因组DNA甲基化芯片分别对MPTP诱导小鼠PD模型和对照小鼠中脑黑质部位进行DNA甲基化比较分析,获得MPTP诱导小鼠PD模型和对照小鼠黑质部位DNA甲基化谱,通过比较MPTP诱导小鼠PD模型和对照小鼠DNA甲基化谱获得DNA甲基化修饰异常的PD相关基因。5.运用重亚硫酸盐测序技术对MPTP诱导小鼠PD模型和对照小鼠黑质部位Uchl1启动子区域甲基化水平进行检测；运用实时荧光定量PCR对MPTP诱导小鼠PD模型和对照小鼠黑质部位Uchl1表达水平进行检测。结果1.MPTP连续腹腔给药的方法能够诱导小鼠出现震颤、肢体僵硬、运动迟缓等类似PD表现；免疫组织化学染色显示模型组小鼠黑质部位TH阳性神经元数目减少,形态异常；Western Blot显示与对照组相比,模型组小鼠中脑背侧组织TH蛋白表达无显著改变(P>0.05),黑质部位TH蛋白表达显著减少(P<0.05)。2.MPTP诱导的小鼠PD模型黑质部位DNA总体甲基化水平较对照组显著降低(对照组8.66%±0.92%vs.模型组7.60%±1.05%,P<0.05)。3.MPTP诱导的小鼠PD模型黑质部位能够检测至(?)Dnmt1, Dnmt3a以及MBPs的rnRNA表达；与对照组相比,模型组小鼠黑质部位Dnmt1、Mbd1及Mecp2的mRNA表达水平显著增高(P<0.05)。4.全基因组DNA甲基化芯片分析发现对照组小鼠黑质部位DNA有723个位点发生高甲基化,模型组小鼠黑质部位DNA有640个位点发生高甲基化。和对照组小鼠相比,在全基因组内筛选出差异甲基化位点共有48个,涉及44个基因,其中甲基化程度增高的基因5个,甲基化程度降低的基因39个。这些甲基化差异基因参与信号转导、分子转运、转录调控、发育、细胞分化、凋亡调控、氧化应激、蛋白降解等生物学过程。5.与对照组小鼠相比,模型组小鼠黑质部位Uchll启动子区域甲基化水平降低,mRNA表达水平增高,差异具有统计显著性(P<0.05)结论在国内外首次利用环境毒素诱导的PD动物模型进行DNA甲基化研究。MPTP诱导的小鼠PD模型黑质部位DNA存在甲基化修饰异常,DNA总体甲基化水平降低,Dnmt1、Mbd1及Mecp2的mRNA表达水平增高。进一步证实MeDIP结合DNA甲基化芯片(MeDIP-Chip)技术是初步构建DNA甲基化谱,筛选基因组DNA中甲基化修饰异常基因的相对有效手段。在MPTP诱导PD小鼠黑质部位筛选出的PD相关甲基化修饰异常的基因可作为进一步深入研究的靶目标。