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目的：
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,它严重威胁女性健康。最新资料表明,在中国乳腺癌的发病率已跃居女性恶性肿瘤的第一位,如何做到乳腺癌的早期预防及降低其发病率己成为亟待解决的现实课题。
研究表明乳腺癌病因复杂,是遗传因素和环境因素共同作用的结果。其中包括基因突变,雌激素暴露,免疫监管失活,生长因子通路的异常等。DNA修复基因的突变近年来成为研究的热点,DNA修复基因主要参与修复内外环境因素所致的DNA损伤。DNA修复基因的突变直接影响DNA修复能力,造成DNA修复能力的缺陷或低下,致使体内DNA损伤不断积累,最终增加细胞癌变的危险。故鉴定DNA修复基因的结构和变异、分析其功能及阐明其在乳腺癌发生中突变易感性作用,对于促进乳腺癌的发生、预防、诊断及治疗策略将是非常重要的。研究表明,个体间DNA修复能力的差异主要取决于DNA修复基因单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphisms,SNP)。
SNP是基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性,它是人类可遗传变异中最常见的一种,占所有己知多态性的90％以上。SNP能导致氨基酸替换进而改变相应修复酶的活性。因此,DNA修复基因SNP是导致DNA修复能力个体差异的重要原因,特别是位于基因编码区或调节区的SNP。已有研究表明,DNA修复基因的遗传多态性可增高个体发生癌症的危险。
DNA修复系统是人体的主要防御屏障,分为直接修复、切除修复、单连断裂修复、双链断裂修复(double strand break repair,DSBR)、损伤跨越修复等。切除修复又分为核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)、碱基切除修复(baseexcision repair,BER)、错配修复(mismatch repair,MMR)。
XPG基因是参与NER过程的基因之一,功能是从3’端切除受损DNA。该基因有48个cSNP位点,XPGArg1104His,rs17655是目前研究者较感兴趣的一个位点。该位点基因G→C,将使其氨基酸产物从天冬氨酸转变为组氨酸,该氨基酸的取代改变可能影响DNA的修复过程。已经证明该基因单核苷酸多态性与膀胱癌和听神经瘤发病有关。
XPC基因也是参与NER过程的基因之一,功能是在第一步的识别阶段XPC是NER过程中重要的损伤识别因子,在损伤识别初期,XPC与HR23B结合成紧密的XPC-HR23B复合体,结合到损伤的DNA分子上,通过一系列的信号转导,启动之后的NER过程。XPC基因突变可引起整个核苷酸切除通路的缺陷,它的多态改变也可能影响核酸切除修复的功能,增加基因组不稳定性,提高肿瘤易感性。该基因有40个cSNP位点。XPC基因第8外显子A1a499Val,rs2228000,C→T的多态引起Ala→Val氨基酸替代;第15外显子Lys939G1n,rs2228001,A→C的多态引起Lys→Gin氨基酸替代。
WRN基因是参与DSBR过程的基因之一,它的功能是修复断裂的DNAd末端使它适合连接酶的连接,它同时还有解旋酶活性。该基因有45个cSNP位点,WRNCys1367Arg,rs1346044位点是一个错义突变位点,T→C的多态引起Arg→Cys氨基酸替代。
本研究拟以中国人群乳腺癌患者及正常健康者静脉血样为研究对象,通过对修复过程中的候选基因多态性位点进行PCR-RFLP方法检测基因型,并应用基于群体的病例一对照相关分析方法及相关的统计学软件处理数据,以期发现各基因与乳腺癌的相关性,并探索各基因与乳腺癌临床病理学参数之间的关系。所获得的结果将有助于乳腺癌的早期诊断及预后判断,并且随着药物基因组学的发展,更有助于制定个体化的诊疗方案。
材料和方法：
本研究采用病例对照研究方法,包括乳腺癌618例,正常对照622例,均为辽宁省人。病例为中国医科大学附属第一医院经病理诊断明确的乳腺癌患者,对照组选自同一医院体检中心进行健康体检的人群,体检结果正常,无肿瘤病史及遗传病史,正常对照均为女性,按年龄与病例组相匹配,在收集血液标本的同时,收集每个研究对象的人口学资料及临床病理参数资料。
采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(Poylmeares Chin ReactionRestriction Fragment Length Poylmorphism,PCR-RFLP)的方法,检测XPG基因XPGAsp1104His多态基因型,XPC基因XPCA1a499Val、XPCLys939Gln多态基因型,WRN基因Cys1367Arg多态基因型。采用碘化钾法从抗凝血中提取基因组DNA。
PCR扩增XPGAsp1104His、XPCA1a499Val、XPCLys939Gln、WRNCys1367Arg多态,各基因设计引物如下:XPGAsp1104His:5-GACCTGCCTCTCAGAATCATC-3和5-CCTCGCACGTCTTAGTTTCC-3,XPCA1a499Val:5-TAAGGACCCAAGCTTGCCCG-3和5-CCCACTTTTCCTCCTGCTCACA-3,XPCLys939Gln:5-ACCAGCTCTCAAGCAGAAGC-3和5-CTGCCTCAGTTTGCCTTCTC-3,WRNCys1367Arg:5-GCCTAATCAGAATGTTAGTT-3和5-TCAGTATrGATGCCTACTTC-3。PCR反应条件为94℃-95℃预变性5min;94℃-95℃变性30-45sec,54℃-63.3℃退火30sec,72℃,30-45sec,35个循环后,72℃,继续延伸7-10min。XPGAsp1104His退火温度为55℃、XPCA1a499Val退火温度为63.3℃、XPCLys939Gln退火温度为62.5℃、WRNCys1367Arg退火温度为54℃。电泳分析PCR产物,并对PCR产物进行酶切,XPGAsp1104His、XPCA1a499Val、XPCLys939GIn、WRNCys1367ArgOt基因位点对应的内切酶分别是Hsp92Ⅱ、SacⅡ、PvuⅡ、Hsp92Ⅱ。取0.25μl产物与相应的限制性核酸内切酶0.25-0.5μl于水浴37℃过夜,用3％琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。
以卡方检验比较各位点多态基因型分布在病例与对照之间分布的差异。所用统计软件为SPSS16.0。
结果：
1、乳腺癌患者XPGAsp1104His位点GG、GC、CC多态基因型频率分别为149(24.1％),326(52.8％),143(23.1％),在健康对照组中GG、GC、CC多态基因型频率分别为179(28.7％),332(53.5％),111(17.8％),以携带野生GG基因型个体为参照,纯合突变CC基因型个体发病风险增高,OR值1.54,95％CI为1.11-2.15,P为0.009。
2、XPGArg1104His的基因多态性与乳腺癌的发病年龄、绝经状态、肿瘤大小、淋巴结转移状态、雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)、孕激素受体(ProgestogenReceptor,PR)、人表皮生长因子受体-2(Human epidermal growth factor receptor2,Her-2)、P53、乳腺癌易感基因1(Breast cancer susceptibility1,BRCA1)蛋白、乳腺癌易感基因2(Breast callcer susceptibility2,BRCA2)等没有相互作用。与乳腺癌的病理类型相关,以浸润性癌和原位癌划分,P＜0.05,至少携带一个突变基因C的个体发生浸润性癌的风险低,OR值0.44,95％CI为0.20-0.95。
3、乳腺癌患者XPCAla499Val位点CC、CT、TT多态基因型频率分别为197(31.9％),332(52.1％),99(16.O％),在健康对照组中CC、CT、TT多态基因型频率分别为256(41.2％),312(50.1％),54(8.7％),以携带野生CC基因型个体为参照,纯合突变TT基因型个体发病风险增高,OR值2.38,95％CI为1.63-3.48,P＜0.001。杂合突变CT基因型个体发病风险也增高,OR值1.34,95％CI为1.05-1.70,P为0.018。
4、XPCA1a499Val的基因多态性与ER状态(P=0.008)、Her-2状态(P=0.013)、P53状态(P=0.007)有关。与发病年龄、绝经状态、肿瘤大小、淋巴结转移数、病理类型、PR、BRCA1、BRCA2等均不相关。
5、乳腺癌患者XPCLys939Gln位点从、AC、CC多态基因型频率分别为213(34.5％),321(51.9％),84(13.6％),在健康对照组中AA、AC、CC多态基因型频率分别为256(41.2％),290(46.6％),76(12.2％),以携带野生AA基因型个体为参照,杂合突变AC基因型个体发病风险增高,OR值1.33,95％CI为1.04-1.69,P为0.02。
6、XPCLys939Gln的基因多态性与BRCA1状态有关,与发病年龄、绝经状态、肿瘤大小、淋巴结转移数、病理类型、ER、PR、Her-2、P53、BRCA2等临床病理参数无相关性。
7、以XPCA1a499Val、XPCLys939Gln两位点均为野生型为参照,至少有一个位点携带突变基因的个体与之相比OR值1.85,95％CI为1.23.2.78,P为0.003;499位点纯合突变同时939位点纯合或杂合突变个体与参照相比OR值7.00,95％CI为3.24-15.11,P＜0.001;499位点杂合突变939位点纯合或杂合突变个体与参照相比OR值2.31,95％CI为1.50-3.55,P＜0.001;499和939两位点均有突变基因的个体与参照相比OR值2.58,95％CI为1.69-3.95,P＜0.001。上述OR值与单独分析一个位点所得OR值高,而当499位点为纯合突变,939位点只要有一个基因突变即可以使发病风险增至3-15倍。
8、乳腺癌患者WRNCys1367Arg位点TT、TC、CC多态基因型频率分别为476(77.0％),137(22.2％),5(0.8％),在健康对照组中TT、TC、CC多态基因型频率分别为477(76.7％),134(21.5％),11(1.8％),以携带野生TT基因型个体为参照,杂合突变TC基因型及纯合突变CC基因型个体发病风险均未见增高。
9、WRNCysl367Arg基因多态性与乳腺癌淋巴结转移状态、PR有关。与乳腺癌的发病年龄、绝经状态、肿瘤大小、肿瘤类型、ER、Her-2、P53、BRCA1、BRCA2等均不相关。
结论：
1、XPG基因可能是乳腺癌易感的候选基因。XPGArg1104His位点CC基因型可能是影响中国地区乳腺癌发病风险的因素之一。
2、XPGArg1104His位点的单核苷酸多态性和乳腺癌病理类型相关;和乳腺癌的发病年龄、绝经状态、肿瘤大小、淋巴结转移情况、ER、PR、HER-2、P53、BRCAl、BRCA2等未见明显相关性。
3、XPC基因可能是乳腺癌易感的候选基因。XPCA1a499Val位点TT、CT基因型、XPCLys939位点AC基因型可能是影响中国地区乳腺癌发病风险的因素之一。
4、XPCA1a499Val位点单核苷酸多态性和乳腺癌临床病理参数ER、Her-2、P53相关;和乳腺癌发病年龄、绝经状态、肿瘤大小、淋巴结转移数、病理类型、PR、BRCA1、BRCA2等临床病理参数之见未见明显相关性。
5、XPCLys939位点单核苷酸多态性和乳腺癌临床病理参数BRCA1相关;和发病年龄、绝经状态、肿瘤大小、淋巴结转移数、病理类型、ER、PR、BRCA2等临床病理参数之间未见明显相关性。
6、XPCA1a499Val、XPCLys939Gln两位点单核苷酸多态性存在相互作用。
7、不能证明WRN基因是乳腺癌的候选基因。
8、WRNCys1367Arg位点单核苷酸多态性和乳腺癌的淋巴结转移和PR相关;和乳腺癌的发病年龄、绝经状态、肿瘤大小、肿瘤类型、ER、Her-2、P53、BRCA1、BRCA2等临床病理参数未见明显相关性。