论文部分内容阅读
[研究背景]脑卒中是一种急性脑血管疾病,是由于大脑血管狭窄或者阻塞而导致相应脑组织缺血,可以分为缺血性卒中和出血性卒中,是全球60岁以上人群中第二大致死原因,其中缺血性脑卒中占脑卒中的77%。脑缺血最主要的发病原因是大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO),缺血之后能量代谢障碍被认为是细胞损伤的始动环节。脑缺血后氧供迅速下降,ATP迅速耗竭,无氧糖酵解加强,大量乳酸产生,进而产生大量的H+离子,H+离子会进一步损伤体内的离子泵,使Ca2+大量涌入细胞内,导致ROS的堆积。过量的ROS会进一步干扰线粒体的功能,导致广泛的脑损伤。因此,深入探究脑缺血后的能量代谢紊乱机制,发现有效的治疗靶点,具有十分重要的意义。TRIM31(Tripartite motif-containing protein 31)属于 TRIM 家族,具有 E3泛素连接酶的活性,可对靶蛋白进行特异性泛素化修饰和降解,参与多种细胞生物学过程,包括增殖、分化、发育、抗病毒、癌变和凋亡等。然而,迄今为止,其在脑缺血性损伤中的作用尚未报道。最近的研究发现TRIM31与葡萄糖代谢紊乱有关。TP53诱导的糖酵解和凋亡调控因子(TP-53 induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)因为其空间结构与2,6-二磷酸果糖激酶(2,6 diphosphate fructose kinase,Fru-2,6-P)结构相似可以降低后者的活性,Fru-2,6-P为磷酸戊糖途径(Pentose phaspate pathway,PPP)的关键酶,因此TIGAR可以抑制糖酵解途径,降低细胞内ROS水平保护缺血脑损伤,但尚不清楚其调节机制。因此本文将探讨TRIM31在局灶性脑缺血损伤中的潜在作用及其分子机制。[研究目的]本课题利用MCAO和OGD体内外脑缺血模型,探讨TRIM31在局灶性脑缺血损伤中的作用及其分子机制。[研究方法]1.明确TRIM31在脑缺血之后神经元中的表达1.1建立小鼠MCAO局灶性脑缺血模型,分别于6h,12h,24h,,48h,72h取小鼠缺血侧大脑皮层和海马缺血半暗带区域组织,利用western blot检测TRIM31的蛋白水平变化。1.2通过免疫荧光双标法检测TRIM31在缺血侧的表达和定位。1.3体外培养原代神经元细胞,建立糖氧剥夺OGD/R(Oxygen-Glucose Deprivation/Reperfusion)模型,OGD/R 90min 复氧 24h 后,利用 western blot检测TRIM31的蛋白水平变化。1.4通过免疫荧光双标法检测TRIM31在原代神经元细胞中OGD/R后的表达变化。2.明确TRIM31在缺血性损伤中的作用2.1通过Longa’s神经学功能评分比较TRIM31基因敲除(TRIM31-/-)小鼠与野生(WT)小鼠脑缺血之后神经学功能的改变。2.2通过TTC染色比较TRIM31-/-小鼠与WT小鼠脑缺血之后的梗死体积。2.3通过HE染色比较TRIM31-/-小鼠与WT小鼠脑缺血之后的组织形态学变化。3.探究TRIM31对TIGAR的调节作用3.1通过免疫学双标法检测TIGAR在WT小鼠和TRIM31-/-小鼠中缺血侧半暗带区域组织的表达和定位。3.2通过western blot检测TIGAR在WT小鼠和TRIM31-/-小鼠缺血侧脑组织中的蛋白水平。3.3体外培养神经细胞系PC12细胞,转染GFP-TRIM3 1质粒以及小干扰siTRIM31分别过表达TRIM31和干扰TRIM31表达,通过western blot检测TIGAR蛋白水平的变化。4.探究TRIM31与TIGAR的相互作用4.1通过免疫荧光双标法利用激光共聚焦检测TRIM31和TIGAR在原代神经元细胞中的共定位情况。4.2 TRIM31与TIGAR的内源性结合。在PC12细胞中,用TRIM31特异性抗体进行免疫共沉淀实验,western blot检测内源性TRIM31与TIGAR的结合。4.3 TRIM31与TIGAR的外源结合。在HEK 293T细胞中,转染GFP-TRIM31和MYC/FLAG-TIGAR,用FLAG特异性抗体进行免疫共沉淀实验,western blot检测外源性TRIM31与TIGAR的结合。5.探究TRIM31对TIGAR泛素化的影响在HEK 293T细胞中进行免疫共沉淀实验,首先转染GFP-TRIM31,MYC/FLAG-TIGAR,HA-Ubiquitin,加入 FLAG 特异性抗体,western blot 检测TRIM31对TIGAR泛素化水平的影响。6.探究干扰TRIM31对能量代谢的影响6.1 CCK8检测细胞存活率。6.2 ATP试剂盒检测细胞ATP水平。6.3 Flow cytometry和荧光检测细胞ROS水平。6.4 western blot 检测细胞 G6PD 水平。7.探究在PC12细胞中干扰TRIM31的表达对线粒体的影响7.1 JC-1试剂盒检测细胞中线粒体膜电位的变化。7.2 RT-PCR检测 mtDNA缺失率。8.探究敲除TRIM31对小鼠脑缺血后糖代谢和线粒体稳态的影响western blot 检测缺血半暗带区域组织 G6PD,PGC-1a,MFN2,MFN1,DRP1的蛋白水平变化。9.探究敲低TIGAR对TRIM31-/-小鼠脑缺血后的影响9.1使用脑立体定位仪在TRIM31-/-小鼠大脑皮层定点注射AAV-shTIGAR干扰TIGAR的表达。9.2 western blot检测TIGAR的敲低效率。9.3通过Longa’s神经功能学评分比较神经功能改变。9.4通过HE染色比较缺血之后脑组织细胞形态变化。9.5 western blot 检测 G6PD 水平。[研究结果]1.在MCAO模型中,在WT小鼠的大脑半暗带,TRIM31的蛋白水平明显降低。通过免疫荧光双标法发现,TRIM31在小鼠大脑神经元中大量表达,脑缺血之后TRIM31水平明显降低。在体外原代神经元培养中进一步发现,OGD/R之后TRIM31的蛋白水平降低。2.脑缺血之后,敲除TRIM31能够改善MCAO之后的神经损伤,TRIM31敲除可以减少脑缺血神经学功能评分。TTC染色结果发现,TRIM3 1-/-组与WT组小鼠MCAO之后相比,TRIM31-/-组梗死体积减小。HE染色结果表明,敲除TRIM31能够使细胞形态的损伤得到一定的改善。3.免疫荧光双标结果显示,在TRIM31-/-组与WT组小鼠MCAO之后,TIGAR的表达升高主要发生在大脑皮层神经元中,敲除TRIM31之后,TIGAR蛋白水平上调更加明显。Western blot的结果进一步证明MCAO之后,敲除TRIM31能够促使TIGAR的蛋白水平增加更加明显。4.在PC12细胞中发现,干扰TRIM31的表达之后,TIGAR的蛋白水平上升。相反,过表达TRIM31之后,TIGAR的蛋白水平降低。并且,在给与OGD/R刺激复氧之后,TIGAR表达增加,干扰TRIM31的表达能够使其增加更加明显。5.免疫荧光双标结果发现,TRIM31与TIGAR在原代神经元细胞中共定位。内源性免疫共沉淀结果表明,在PC12细胞中,TRIM31能够与TIGAR结合,并且在给与OGD/R刺激复氧之后,结合减少。外源性免疫共沉淀结果同样表明,在HEK293T细胞中,TRIM31能够与TIGAR结合。6.外源泛素化实验结果发现,通过在HEK 293T细胞中共转染GFP-TRIM31,MYC/FLAG-TIGAR 和 HA-Ubiquitin,TRIM31 可以促进 TIGAR 的泛素化。7.在PC12细胞中,干扰TRIM31的表达,OGD/R之后能够提升细胞活力。荧光,流式细胞术和Western blot结果发现,干扰TRIM31的表达,OGD/R之后能够减少ROS的增加,减缓G6PD的减少。8.在PC12细胞中发现,干扰TRIM31的表达,OGD/R之后能够减缓线粒体的损伤。表现为减轻线粒体膜电位的降低和线粒体DNA缺失率的增加。9.在MCAO模型中,TRIM31-/-组与WT组相比,敲除TRIM31基因能够减缓G6PD的减少,减轻线粒体合成相关蛋白PGC-1a和线粒体融合相关蛋白MFN1,MFN2的降低以及抑制线粒体动力相关蛋白DRP1的增加。10.注射腺相关病毒AAV-shTIGAR在TRIM31敲基因小鼠大脑中可敲低TIGAR的表达。Western blot发现敲低效率明显。荧光观察病毒扩散范围,主要在海马与皮层处。通过HE染色,神经学功能评分和western blot发现,敲低TIGAR的表达能够消除脑缺血之后TRIM31基因敲除引起的保护作用。[研究结论]在脑缺血病理进程中,TRIM31可以通过结合TIGAR,负调控其表达,促进其泛素化降解,减少磷酸戊糖通量,增加ROS产生,加剧线粒体损伤,介导缺血脑损伤。