研究背景在生命活动中由外伤、感染、肿瘤及先天性疾病等原因造成的骨缺损十分常见,是骨科临床常见的难症之一。大的骨缺损难以自行愈合,需要植骨材料修复,但目前临床使用的骨修复材料各有利弊,不能达到修复骨缺损理想材料的要求。近年来随着组织工程技术的发展,研制寻找良好的骨替代材料,与种子细胞联合培养,同时采用缓释技术添加信号因子,构建有生命活性的组织工程骨复合体,无疑将会对临床修复骨缺损带来重大的科学意义和实用价值。羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)是人体骨组织的主要成分,自20世纪70年代末,羟基磷灰石作为新型生物材料问世以来,已在材料学科和医学界,广泛应用于整形外科、矫形外科、口腔科等医学相关领域各类骨缺损的修复。但普通的多孔型羟基磷灰石,质脆强度低,生物机械性能较差；致密型羟基磷灰石植入后不能被新骨完全替代,在局部形成占位。近些年来,利用纳米技术制备的纳米级组织工程骨材料,在纳米结构单元或纳米数量级下生产新型材料,其结构与天然骨相似,有助于人体细胞及大分子对其识别,从而可有效提高材料的生物活性、利用度和生物相容性,符合理想人工骨的性能要求。目前对纳米级羟基磷灰石人工制品的研究取得了长足的进展,并在临床上获得了广泛的应用,但是仍距离结构功能一体化的要求相差很远,还存在某些不可克服的缺点,如缺少连通的、均匀的孔结构,不利于骨组织的生长；其降解速度与天然骨组织生长替代速度不协调；力学强度与天然骨组织的力学性能不匹配等。而且国内外大多数学者认为单纯的羟基磷灰石只具有骨生长引导作用,但不具有骨诱导活性。天然骨是无机矿物质与生物大分子规则排列所组成的复合体,可被看成是一种有机／无机的纳米复合材料。因此以羟基磷灰石为基础构建与天然骨类似的复合骨替代材料已成为当前的研究热点。血管生成与血运重建是创面愈合、移植组织存活的关键。VEGF又称血管通透性因子(vascular permeability factor, VPF),是目前发现的作用最强的促血管生成细胞生长因子,VEGF在骨的形成及修复中也起到重要的作用,许多研究表明,VEGF是通过3个方面来实现的(1)通过促进内皮细胞增殖、血管生成参与骨发育形成。(2)作为旁分泌因子或直接参与骨形成与代谢：有研究发现,VEGF可促进血管内皮细胞分泌胰岛素样生长因子-1(IGF-1)及内皮素-1(ET-1),而这些细胞因子刺激人成骨细胞生长。(3)VEGF还可通过作用于人成骨细胞强表达的flt-1受体增加人成骨细胞移动和分化功能。VEGF本身也可以直接作用于成骨细胞,已有实验证明VEGF可以结合成骨细胞,增加其移动和分化功能,但不能促进其增殖。研究目的将无机纳米羟基磷灰石和有机羧甲基壳聚糖(CMCTS)制备成与天然松质骨的力学特性、几何形状和表面性质类似的三维孔洞网状结构,形成多孔状、孔隙率高、力学性能好的二级孔道的三维网络结构纳米人工骨基质材料,构建一种结构功能一体化的复合支架材料。同时,依照组织工程骨复合体三要素(支架材料、种子细胞、信号因子)的原则,利用基因转染技术将VEGF转染BMSCs植入复合材料内,使BMSCs在发挥成骨作用的同时,表达分泌VEGF,从而构建一种有生命活性的骨组织工程骨复合体,以期提高骨缺损修复的效果,为研制理想的骨缺损修复替代材料提供一定的实验依据和理论基础。研究方法1nHA/CMCTS复合支架材料的制备nHA粉体由本实验室采用化学沉淀法制备,京尼平(Genipin)做交联剂,通过粒子沥滤法、冷冻干燥法成功制备nHA/CMCTS多孔复合材料。2nHA/CMCTS生物安全性测试动物模型建立及分组后进行肝肾功能检测,实验组取移植nHA/CMCTS复合材料周围骨组织标本,对照组取缺损处骨组织标本进行组织学观察。体外生物安全性测试。利用细胞形态观测法检测其毒性。3.构建pcDNA3.1-VEGF165重组载体提取细胞总RNA,以提取的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下反转录合成VEGF165cDNA序列,以VEGF165基因cDNA为模板,用引物特异性扩增。用Wizard PlusMinpreps DNA纯化系统抽提并纯化噬菌粒DH5α,进行3.5pMD18-T和VEGF165基因的双酶切,用凝胶回收试剂盒,自凝胶中分别回收双酶切后的pMD18-T片段和VEGF165基因,连接两个基因,制备大肠杆菌DH5α感受态细菌,构建重组载体并鉴定后,进行质粒的扩增与纯化。4骨髓间充质干细胞培养抽取骨髓,分离骨髓单个核细胞,反复洗涤后悬浮于含10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃,5%C02及饱和湿度培养箱中培养并换液,观察细胞生长融合情况。胰蛋白酶消化传代。自第三代细胞条件培养基培养(体积分数10%胎牛血清、地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸钠0.01mmol/L和维生素C0.05g/L)。对不同时期的骨髓间充质干细胞进行形态观察,在质粒转染之前对骨髓间充质干细胞进行了表面标志物鉴定。5pcDNA3.1-VEGF165转染骨髓间充质干细胞(电转染法)电转染前处理哺乳动物细胞,pcDNA3.1-VEGF165转染骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石／羧甲基壳聚糖复合材料,即将制备的纳米羟基磷灰石／羧甲基壳聚糖浸泡于已转染pcDNA3.1-VEGF165的第三代骨髓间充质干细胞悬液内48小时,进行材料与细胞复合。6动物模型制备将实验兔前肢桡骨中段大约1.8cm的骨质连同骨膜完全切除。随机选择一侧骨缺损作为实验组,局部植入转染PCDNA3.1-VEGF165骨髓间充质干细胞的纳米羟基磷灰石／羧甲基壳聚糖复合材料(VEGF+n-Ha/CMCTs)或者单纯植入纳米羟基磷灰石／羧甲基壳聚糖复合材料(n-Ha/CMCTs);两组的对侧分别作为作为空白对照组1和空白对照2。7一般情况观察术后观察动物的一般情况、局部炎症反应、切口愈合时间8.术后X线观察术后4周,12周及24周,行常规X射线检查,观察骨缺损处断端及骨形成及修复情况。Lane-Sandhu法评分标准进行评分。9.取材分别于术后6周,12周,24周处死动物后沿原缝合切口切开达新生骨膜,仔细分离,观察骨缺损区愈合及修复情况,切取桡骨标本,取中段缺损处修复的组织,将所取标本以10%中性甲醛固定。10.HE染色标本经脱钙,梯度脱水,透明、浸蜡,制备厚度为5μm切片,苏木素-伊红(H E)染色,观察术后复合材料降解及新生骨生长的情况,测量新生骨面积。11.生物力学性能检测分别于术后6周,12周,24周采用三点弯曲法对实验组及对照组新生骨进行生物力学性能测试,加载速率为2mm/min。12.分子生物学检测提取标本总蛋白,Western Blot法检测组织内血管内皮细胞生长因子(VEGF),血小板内皮细胞黏附分子1(CD-31),骨桥蛋白(OPN),胰岛素样生长因子1(IGF-1)的表达水平。13.统计分析采用SPSS13.0统计软件,定量数据均以均数±标准误表示,应用各组间单因素方差分析进行统计。P<0.05为有统计学意义。研究结果1采用粒子沥滤法制备了高孔隙率nHA/CMCTS多孔复合材料。复合材料的成分无变化,仍然为羟基磷灰石与壳聚糖,并且羧甲基以及胺基分别与羟基磷灰石的羟基或Ca2+发生了不同程度作用,形成了较为牢固的界面结合。该多孔材料最高孔隙率高达87%,孔形不一,以圆形为主,其尺寸分布大约从几微米到600微米,具有良好的贯通性,非常有利于组织在其中的长入与扩展。当复合材料中CMCTS含量为40%,复合材料／造孔剂的质量比为1：1时,多孔材料的孔隙率接近75%,其抗压强度可达21MPa以上,可以满足骨组织工程支架材料的要求。复合材料经SBF溶液浸泡之后的SEM分析,从中可以看到孔壁周围出现纳米级颗粒。分析认为具有骨生物活性的无机陶瓷材料在生理环境中通过与体液发生一系列离子交换和化学沉积反应,可在表面形成类骨碳酸羟基磷灰石晶体,与宿主骨组织发生化学键和,并具有诱导骨组织形成的作用2复合材料的组织学及肝肾功能检测实验组3周可以见到急慢性炎细胞浸润,无异物巨细胞反应,未见骨坏死；对照组3周以炎性充血为主,并可见慢性炎症细胞浸润,实验组6周可见轻微炎症反应,骨组织未见坏死、基本正常；对照组6周可见少量炎细胞,骨组织基本正常,未发现引起骨组织明显的异物巨细胞反应及骨坏死,提示nHA/CMCTS具有良好的组织相容性。本实验对nHA/CMCTS进行了实验动物的肝肾毒性检测,各组动物血清ALT、AST、Cr和Urea的均值,经单因素方差分析,4组动物血清中ALT、AST、Cr和Urea的水平各组内组间比较及各组内组间两两比较均没有统计学意义,提示nHA/CMCTS复合材料未引起肝肾毒损害具有一定的安全性。小鼠胚胎成纤维细胞在复合材料培养不同时间后的细胞形态观察见细胞突充分伸展,可见多角形细胞,细胞逐渐铺满视野。根据细胞形态分析标准,复合材料无细胞毒性。3.成功构建了构建pcDNA3.1-VEGF165重组载体采用VEGF165cDNA为模板,将VEGF165经大量扩增后,以1%琼脂糖凝胶电泳,在标准核酸分子量附近出现一条特异性扩增条带,片段大小约为237bp左右,图像分析表明产物纯度较高,无非特异性带干扰,适宜进行基因转化；分别以EcoR I和HindⅢ内切酶对二者酶切,结果前者在5.4kb左右有一条特异性条带,后者条带位于225bp左右；用PCR法对重组PcDNA3.1-VEGF165质粒进行鉴定,可见酶切产物为两个条带,分别在5.4kb、230bp左右片段,测序证实其序列与GENEBANK中兔VEGF序列相同。PcDNA3.1-VEGF165基因测序图峰值清晰,无双峰干扰。4大体观察发现两组术后均无明显炎症反应,创面无感染,切口愈合顺利。5X线评分结果不同时期X射线照片显示VEGF-nHA/CMCTS实验组较单纯nHA/CMCTS组及两个空白对照组骨愈合明显快,按Lane-Sandhu法评分标准评分,所得数据进行方差分析,Lane-Sandhu组织学评分差异均有统计学意义。6HE染色观察所见术后6周VEGF-nHA/CMCTS实验组材料中间可见少量骨髓颗粒细胞,植入复合材料未见明显降解；术后12周VEGF-nHA/CMCTS实验组复合材料明显减少,骨髓颗粒细胞明显增多,并可见骨生长；术后24周VEGF-nHA/CMCTS实验组复合材料明显破碎减少,骨及纤维性骨痂生长良好。另将HE染色组织切片根据Lane-Sandhu组织学评分标准进行分析发现,各组组织学评分随着植入时间的延长而增加；在第6周和第12周,VEGF+n-Ha/CMC组评分不仅显著高于两个对照组,且高于n-Ha/CMC组,在第24周,VEGF+n-Ha/CMC与n-Ha/CMC相比无差异；在第6,12,24周,n-Ha/CMC组显著高于两个对照组；在各个时间点,空白对照组1与空白对照组2之间无差异。HE染色组织切片发现VEGF+n-Ha/CMCTS组较其他各组微小血管形成较多,有利于新骨的生长。7生物力学性能检测实验组及对照组进行采用三点弯曲法对新生骨进行生物力学性能测试,加载速率为2mm/min。结果显示,抗弯强度随时间延长而增大,在VEGF+n-Ha/CMCTS组,从6周起强度突然增大,在12周时已接近达到最大值。而在Ha/CMCTS组,增大幅度则较为平缓,在24周时也接近最大值。在两组空白对照组,抗弯强度随时间延长增大不明显,统计结果显示,VEGF+n-Ha/CMCTS及n-Ha/CMCTS实验组抗弯强度差异性显著高于高于对照组,12周、24周显著性水平明显不同(p<0.05),但两个对照组之间无差异。8分子生物学检测术后6周,对四组组织内血管内皮细胞生长因子(VEGF),血小板内皮细胞黏附分子1(CD-31),骨桥蛋白(OPN),胰岛素样生长因子1(IGF-1)蛋白表达水平进行检测,发现VEGF+n-Ha/CMCTS组VEGF, CD-31, OPN, IGF-1的表达不仅显著高于两个对照组,且高于n-Ha/CMCTS组：n-Ha/CMCTS组的表达水平较两个对照组升高,而空白对照组1和空白对照组2之间,上述因子蛋白表达无差异。结论1该复合材料孔隙率、抗压强度,可以满足骨组织工程支架材料的要求。nHA/CMCTS植入大白兔骨缺损处未见引起骨组织明显的炎症反应及骨坏死,肝肾功能检测未发现有肝肾毒性,提示nHA/CMCTS具有良好的组织形容性及生物安全性。2.纳米羟基磷灰石／壳聚糖复合VEGF转染BMSCs构建骨复合体植入骨缺损模型后,促进新生骨的生长,使骨折愈合加快,抗弯能力强,治疗效果明显。3.纳米羟基磷灰石／壳聚糖复合VEGF转染BMSCs构建骨复合体植入骨缺损模型后,组织内VEGF, CD31, OPN, IGF-1表达水平升高,提示本模型植入后可能通过促进血管新生及直接促进成骨两个方面发挥作用。4.将VEGF基因转入BMSCs后与复合材料结合,构建了一种新型的有生命活性的骨组织工程骨复合体,为研制理想的骨缺损修复替代材料提供一定的实验依据和理论基础,为提高组织修复与愈合质量与速度提供新的思路。