顺磁标记是指将含有未成对电子的顺磁性物质引入到蛋白质中得到顺磁限制的方法,常用的顺磁效应主要包括：赝接触位移(PCS)、顺磁弛豫增强(PRE)、残余偶极耦合(RDC)。这些顺磁效应包含丰富的蛋白质结构信息可用来研究蛋白质。由于大多数蛋白质都没有顺磁金属离子的结合位点,所以研究中通常采用不同的方法将金属结合标签连接到蛋白质上,常用的方法有化学标签的二硫键连接和多肽融合。由于二硫键产物在还原环境或高pH条件下不能稳定存在,从而限制了其应用。多肽融合虽然能避免二硫键连接中存在的问题,但是在蛋白质中缺少合适的嵌入位点。因此,本论文探索不同的顺磁标记方式,进而获得蛋白质的顺磁结构限制,研究内容主要包括以下两部分：一、通过稀土配合物与蛋白质的特异性非共价作用标记蛋白质在吡啶-2,6-二甲酸(L1)分子上引入不同的取代基得到了一系列衍生物L(L=L2,L3,L4,L5),这些配体都能与稀土形成3：1稳定的配合物[Ln(L)3]n-(L=L1,L2,L3,L4,L5)。实验表明这一系列稀土配合物均能与蛋白质ubiquitin产生特异性的相互作用。通过15N-HSQC实验测定得到了配合物[Ln(L)3]n和ubiquitin相互作用的解离常数Kd,赝接触位移PCS,进而拟合得到不同配合物[Ln(L)3]n-的△χ张量及相关参数。通过分析数据,得到如下结论：(1)改变配合物[Ln(L)3]n取代基和电荷,可以改变配合物与蛋白质的结合常数。(2)PCS的大小与解离常数Kd及配合物[Ln(L)3]n-的结构有关。(3)不同配合物[Ln(L)3]n-可获得不同的△χ张量,快速得到多个角度和距离的限制,可以应用到蛋白质的结构。(4)由于五种配合物[Ln(L)3]n-的体积大小不同以及ubiquitin相互作用界面的柔性,拟合得到的这五种配合物[Ln(L)3]n的金属离子位置略有不同。二、通过蛋白质半胱氨酸的巯基与碳碳双键类似Michael加成反应标记蛋白质在Michael加成反应标记蛋白质的基础上,探索了影响Michael加成反应的因素；研究了经标签修饰的蛋白质与顺磁金属离子的作用。具体实验内容和分析结果如下：通过1H NMR检测室温下不同pH时标签L6与半胱氨酸Cys和赖氨酸Lys的反应活性,当pH=7.0,7.5,8.0,8.5时,标签L6与Cys都完全反应；在pH=7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0,10.5的条件下,标签L6与Lys都不反应。通过上述的实验说明标签L6只与Cys的巯基发生特异性的加成反应。在室温,pH=7.6的条件下,通过15N-HSQC谱图检测了ubiquitin的4种突变体ubiquitin T22C, ubiquitin A28C, ubiquitin G47C, ubiquitin E64C与标签L6的加成反应,通过比较4种突变体的反应产率来确定它们的反应活性。实验表明蛋白质的4种突变体显示出不同的活性,活性大小顺序为：ubiquitin A28C<ubiquitin T22C<ubiquitin G47C<ubiquitin E64C。继而在相同的反应条件下,比较不同的标签L6,L7,L8与ubiquitin突变体T22C的加成反应活性,研究表明标签L6,L7,L8有不同的活性,活性大小顺序为：L6<L7≈L8。通过上述两个实验说明Michael加成反应标记蛋白质的反应活性,不仅与标签的活性有关,而且还与蛋白质取向朝向溶剂半胱氨酸的活性有关。通过Michae1加成反应,分别将标签L7,L8共价连接到ubiquitin突变体T22C,A28C上,得到4种相应的复合物ubiquitin T22C-L7, ubiquitin A28C-L7, ubiquitin T22C-L8, ubiquitin A28C-L8。在这4种复合物中加入不同顺磁金属离子Ln3+(Ln3+=Dy3+, Tb3+, Tm3+, Yb3+),以抗磁金属离子y3+作为参比,分别计算4种复合物中加入不同顺磁金属离子时的PCS值。进而,利用复合物ubiquitinT22C-L7中滴加顺磁金属离子Tm3+和Yb3+的PCS数据来拟合出AZ张量及相关参数,由于残基22位于ubiquitin结构较柔性的loop区域,loop区的运动导致PCS平均化,产生较小的△X张量。