本研究采用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术,检测了南阳牛、秦川牛、郏县红牛、中国荷斯坦牛和牦牛5个群体共521个个体的MRF家族、MSTN、GHRH和GHR基因的遗传变异,分析了其遗传结构和遗传多样性,并对南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个中国黄牛群体在上述位点的多态性与其生长性状进行了相关分析,以检验这些基因的多态对南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个黄牛群体生长发育的遗传效应,以期发现对重要经济性状具有显著效应的遗传标记,为中国黄牛的高效选育和分子标记数据库的建立、种质资源保护与利用提供遗传学依据。本研究获得了以下结果:1.牛MSTN基因变异及其与生长性状的相关分析1.1 PCR-SSCP检测结果表明,MSTN基因外显子1和3在5个群体中均未发现多态。利用限制性内切酶TaqI对5个群体MSTN 5’调控区约1346 bp片段进行PCR-RFLP分析,发现该片段不存在限制性内切酶TaqI的多态位点,证明已经公布的牛MSTN序列(GenBank No. AF348479)存在测序错误,-360位(相对于ATG转录起始点)碱基应该为A。1.2利用限制性内切酶DraI对5个群体MSTN 5’调控区约1346 bp片段进行PCR-RFLP分析,结果表明牛MSTN 5’调控区PCR-RFLP-DraI多态位点存在2个等位基因T和A。南阳牛、秦川牛、郏县红牛、中国荷斯坦牛和牦牛等位基因T/A的基因频率分别为0.955/0.045、0.973/0.027、0.972/0.028、0.918/0.082和1.000/0.000。这个多态表现为TT、TA和AA 3种基因型。牦牛个体全部为TT型,即在牦牛群体中未出现T>A突变;南阳牛、秦川牛和中国荷斯坦牛群中出现了TT和TA两种基因型,无AA纯合体;而在108头郏县红牛群体中,除了TT和TA型个体,还出现了1个AA纯合个体。在5个群体中,TT基因型为优势基因型,T为优势等位基因。群体卡方适合性检验表明,南阳牛、秦川牛和中国荷斯坦牛3个群体处于Hardy-Weinberg平衡状态;而郏县红牛群体偏离Hardy-Weinberg平衡状态。中国荷斯坦牛、郏县红牛、南阳牛、秦川牛和牦牛5个群体遗传多态指数h/Ne/S/PIC分别为0.1505/1.1772/0.2835/0.1345、0.0864/1.0946/0.1842/0.0826、0.0545/1.0576/0.1279/0.0530、0.0523/1.0552/0.1237/0.0501和0.0000/1.0000/0.0000/0.0000,因此其群体遗传多态性丰富程度从大到小依次为中国荷斯坦牛、郏县红牛、南阳牛、秦川牛和牦牛。1.3利用最小二乘法对MSTN-DraI多态位点与3个黄牛群体(南阳牛、秦川牛、郏县红牛)生长性状进行相关分析,结果表明年龄对南阳牛体重、体高、体斜长、胸围和坐骨端宽影响极显著(P<0.01),说明不同年龄阶段南阳牛的生长发育存在明显差异,生长快慢与年龄有直接关系。多重比较表明,18月龄南阳牛TT型个体的体高显著高于TA型个体(P<0.05),6月龄两种基因型个体之间胸围差异显著(P<0.05)。2.牛MRF基因家族多态性及其与生长性状的相关分析2.1利用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术在牛MRF基因家族4个基因(Myf5、MyoD、Myf6、MyoG)检测到4个多态位点。PCR-RFLP-TaqI检测到牛Myf5-1位点存在三种基因型,该位点多态是由该基因内含子2的1948 bp (Accession No. M95684)处的SNP (CAA/CGA)引起的。在南阳牛、秦川牛、郏县红牛、中国荷斯坦牛和牦牛5个群体中等位基因A/B的频率分别为0.173/0.827、0.242/0.758、0.248/0.752、0.262/0.738和0.031/0.969,等位基因B为优势等位基因。牦牛群体在该位点未发现AA型纯合体。卡方检验表明5个群体均处于Hardy-Weinberg平衡状态。PCR-SSCP检测到牛Myf5-2位点有1个SNP(A>T),位于Myf5基因外显子1的609 bp (Accession No. M95684),未引起氨基酸的改变。在南阳牛、秦川牛、郏县红牛和牦牛4个群体中,该多态表现为AA、AB和BB三种基因型,等位基因A/B的频率依次为0.443/0.557、0.475/0.525、0.467/0.533和0.199/0.801。在南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个黄牛群体中,杂合个体所占比例较小,基因频率分布接近相等;在牦牛群体中,BB型为优势基因型,B为优势等位基因。南阳牛、秦川牛、郏县红牛和牦牛4个群体在该位点均偏离Hardy-Weinberg平衡状态。利用PCR-SSCP技术检测到牛MyoD基因内含子2 (MyoD-intron2)和牛Myf6基因编码区分别存在1个SNP (C>T),Myf6位点的SNP位于Myf6基因(Accession No. AB110601)的338 bp,未引起氨基酸的改变。南阳牛、秦川牛、郏县红牛和中国荷斯坦牛在MyoD-intron2位点等位基因A/B的频率分别为0.904/0.096、0.882/0.118、0.926/0.074和0.980/0.020。南阳牛、秦川牛和郏县红牛在Myf6位点等位基因A/B的频率分别为0.983/0.017、0.995/0.005和0.997/0.023。在这2个位点上,发现AA和AB两种基因型,牦牛全部为AA型个体,说明牦牛群体的这两个位点可能已经达到纯合;其它所研究群体均未发现BB型纯合体,AA型纯合体占绝大多数,AA基因型为优势基因型,A为优势等位基因,且群体处于Hardy-Weinberg平衡状态。南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个黄牛群体的Myf5-1和Myf5-2位点属于(或接近)中度多态位点,MyoD-intron2和Myf6位点属于低度多态位点。南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个黄牛群体平均PIC分别为0.2023、0.2175和0.2123,因此其遗传多态性丰富程度从高到低依次为秦川牛、郏县红牛和南阳牛。2.2利用最小二乘法对这4个位点多态与南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个黄牛群体生长性状进行相关分析,结果表明:在Myf5-1-TaqI位点,18月龄南阳牛AA型个体的体高极显著高于AB和BB型个体(P<0.01);郏县红牛AA型个体的坐骨端宽显著高于其它两种基因型个体(P<0.05) ;而秦川牛AA型个体的体高和十字部高显著低于AB和BB型个体(P<0.05); Myf5-2位点3种基因型对南阳牛体高和体斜长影响显著,6月龄和12月龄BB型个体体高均显著高于AA型个体(P<0.05);6月龄的BB型个体的体斜长也显著高于AA型个体(P<0.05)。在秦川牛群体中,杂合个体的腰角宽显著高于纯合个体(P<0.05);在MyoD-intron2位点,秦川牛除了体高和十字部高外,AB型个体的其它性状均显著高于AA型个体(P<0.05)。在Myf6位点,18月龄南阳牛AA型个体的坐骨端宽显著高于AB型个体(P<0.05)。3.牛GHRH基因外显子3多态与生长性状的相关分析3.1利用PCR-RFLP检测了5个群体GHRH基因外显子3限制性内切酶HaeⅢ的酶切多态性。在南阳牛、秦川牛、郏县红牛、中国荷斯坦牛和牦牛5个群体中,等位基因A/B的频率分别为0.314/0.686、0.259/0.741、0.243/0.757、0.265/0.735和1.000/0.000。在牦牛群体中未发现GHRH exon3-HaeⅢ多态,全部个体为AA型。在南阳牛、秦川牛、郏县红牛和中国荷斯坦牛群体中主要为BB型和AB型个体,等位基因B为优势等位基因。南阳牛、秦川牛、郏县红牛和中国荷斯坦牛4个群体处于Hardy-Weinberg平衡状态。南阳牛、秦川牛、郏县红牛和中国荷斯坦牛群体的遗传多态指数h/Ne/S/PIC分别为0.431/1.757/0.474/0.338、0.384/1.623/0.559/0.310、0.368/1.582/0.590/0.300和0.390/1.638/0.548/0.314。该位点的0.25<PIC<0.50,属于中度多态位点。5个群体的遗传多态性丰富程度从大到小依次为南阳牛、中国荷斯坦牛、秦川牛、郏县红牛和牦牛。3.2利用最小二乘法对GHRH exon3-HaeⅢ位点多态与南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个黄牛群体生长性状进行相关分析和多重比较发现,对于6月龄南阳牛,除了胸围和坐骨端宽外,体重、体高、体斜长和日增重在杂合个体与纯合的BB型个体之间差异显著(P<0.05);24月龄时,AA型和AB型个体的体重和日增重显著高于BB型个体(P<0.05)。GHRH exon3-HaeⅢ多态对郏县红牛的体斜长和胸围的效应达到显著水平,表现为BB型个体显著低于杂合个体(P<0.05)。4.牛GHR基因外显子10多态与生长性状的相关分析4.1利用PCR-SSCP研究了GHR基因外显子10的SNP (A>G)在5个群体中的遗传特性。在南阳牛、秦川牛、郏县红牛、中国荷斯坦牛和牦牛5个群体中,等位基因G/A的频率分别为0.443/0.557、0.444/0.556、0.495/0.505、0.164/0.836和0.114/0.886。牦牛群体未发现GG型个体;在牦牛和中国荷斯坦牛群体中主要为AA型,等位基因A为优势等位基因。在南阳牛、秦川牛和郏县红牛群体中,3种基因型分布比较均衡。南阳牛、秦川牛、牦牛3个群体处于Hardy-Weinberg平衡状态,而郏县红牛和中国荷斯坦牛群体则偏离Hardy-Weinberg平衡状态。南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个群体在该位点0.25<PIC<0.50,属于中度多态位点,中国荷斯坦牛和牦牛群体PIC<0.25,属于低度多态位点。依据遗传多态指数,南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个黄牛群体在该位点的群体多态丰富程度比较接近一致。4.2对牛GHR基因外显子10的SNP基因型对南阳牛、秦川牛和郏县红牛生长性状的遗传效应进行了分析。在南阳牛生长过程中,GHR基因外显子10的SNP (A>G)对坐骨端宽性状的效应显著(P<0.05);6月龄南阳牛纯合GG型个体的体高显著高于杂合个体和纯合AA型个体(P<0.05)。12月龄南阳牛GG型个体的胸围显著高于杂合个体(P<0.05)。