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研究背景和研究目的男性不育已成为一个全球性的人口健康问题,而精子质量的下降是男性不育的主要原因。二战以来,人类精子密度持续下降了近50%,正常形态精子的百分比标准由1987年的50%降至近年的4%,这给人类生存带来一个极其危险的信号。该问题已引起国内外泌尿、生殖专家的广泛关注,相关的基础与临床研究相继展开。睾丸是精子发育的重要场所,影响其正常结构和功能的外界因素众多,大体上可分为物理因素、化学因素以及生物因素。其中,物理因素中的高温对精子的损伤机制成为近年的研究热点。对于大多数体细胞而言,热休克反应（heat shock response,HSR）是生物机体在热应激（或其他应激）状态下所表现的一种防御适应性反应。但对于睾丸内的生殖细胞（主要是减数分裂细胞和减数分裂后的细胞）,热应激并未促发这种保护性反应。相反,受影响的生殖细胞通过凋亡途径被清除了。有研究表明,热应激可导致精子浓度降低,精子活性及运动能力受损。此外,热应激下精子头部的某些性状也可发生改变,并直接影响受精。但热应激导致精子发育功能障碍的本质原因尚不明确。既往研究提示,热应激可能通过各种途径最终引发生精细胞凋亡。这可能在一定程度上说明热应激致精子数量减少的本质原因,却很难解释由热应激所导致的精子活性及运动能力损伤。因此,一个可能的推测是,多种因素联合作用共同介导了热应激下精子损伤的发生。多种热休克蛋白（heat shock protein,HSP）和热休克转录因子（heat shock factor,HSF）参与精子发生过程。其中,热休克蛋白A2（heat shock protein A2,HSPA2）对精子发生及其成熟均起到至关重要的作用。人基因组共编码6种HSF,即HSF1、HSF2、HSF4、HSF5、HSFX和HSFY。既往研究表明,所有HSF家族成员在哺乳动物睾丸中均有表达。其中HSF5和HSFY表达主要见于睾丸,而HSF1、HSF2、HSF4的表达则没有明显的组织特异性。研究发现,HSF1或HSF2的缺失对精子数量及精子头部形态可造成不同程度的影响,同时敲除HSF1和HSF2的小鼠因精子发生完全受阻而绝对不育。更多研究显示,HSF4与白内障的发病相关,HSF5与HSFY均为精子发生过程中的重要因子。目前,关于HSFX的功能还知之甚少。既往研究表明,HSF1和HSF2似乎能够调控HSPA2的表达,但尚缺乏可靠证据。大量研究显示,表观遗传机制可能是调控HSPA2表达的首要因素,而DNA甲基化是调节人类细胞中HSPA2表达最重要的表观遗传机制之一。本研究首先通过43℃高温舱构建了大鼠生殖系统的热应激模型,对HSPA2及几种HSF（HSF1、HSF2、HSF5、HSFY）进行了定量分析,但由于研究设计的不足,实时荧光定量PCR（RTQ-PCR,Quantitative Real-time PCR）与蛋白质印迹（WB,western blot）的实验结果不一致。其中一个可能的原因就是转录和翻译存在时间和空间上的差异,这个问题可能通过设置不同的检测时相点得以解决。为此,课题组通过43℃细胞培养箱构建了小鼠精母细胞GC-2的热应激模型,并设置了不同的检测时相点,再一次对相关基因进行了定量分析。在前期研究的基础上,课题组以重组人源HSF1与HSF2同源三聚体及预测到的人HSPA2基因启动子为重点研究对象,并根据HSE的基本特征设计一段23 bp的DNA作为阳性对照,利用凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）技术初步探索了HSPA2与HSF1及HSF2之间的内在关系,又通过构建大鼠生殖系统的热应激模型,运用甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）和重亚硫酸盐测序PCR（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测了大鼠睾丸组织中Hspa2基因启动子区Cp G岛的甲基化状况,试图揭示热应激条件下HSPA2表达下调的内在机制。研究方法1.利用WB法检测热应激组与对照组大鼠睾丸中HSPA2及HSF1、HSF2、HSF5、HSFY蛋白水平,检测热应激组与对照组小鼠精母细胞GC-2中HSPA2及HSF1、HSF2蛋白水平（预实验结果显示GC-2中HSF5、HSFY表达量过低,未行检测）;2.利用RTQ-PCR法检测热应激组与对照组大鼠睾丸中HSPA2及HSF1、HSF2、HSF5、HSFY对应的mRNA水平,检测热应激组与对照组小鼠精母细胞GC-2中HSPA2及HSF1、HSF2对应的mRNA水平（预实验结果显示GC-2中HSF5、HSFY表达量过低,未行检测）;3.利用SPSS软件进行统计分析;4.利用凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）技术初步探索HSPA2与HSF1及HSF2之间的内在关系;5.运用甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）和重亚硫酸盐测序PCR（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测大鼠睾丸组织中Hspa2基因启动子区Cp G岛的甲基化状况。研究结果1.大鼠生殖系统热应激模型研究结果1.1热应激组HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY基因mRNA的相对表达值分别为（0.50±0.17）、（0.62±0.44）、（0.38±0.20）、（0.63±0.46）、（0.52±0.17）,蛋白的相对表达值分别为（1.20±0.12）、（0.78±0.08）、（0.82±0.19）、（1.34±0.31）、（1.15±0.16）;1.2对照组HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY基因mRNA的相对表达值分别为（1.16±0.19）、（1.33±0.37）、（0.83±0.13）、（1.84±1.13）、（1.01±0.15）,蛋白的相对表达值分别为（1.28±0.16）、（0.97±0.09）、（0.91±0.18）、（1.57±0.48）、（1.12±0.09）;1.3热应激组HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY基因mRNA的相对表达值显著低于对照组（P＜0.05）,热应激组HSF1基因蛋白相对表达值显著低于对照组（P＜0.05）,热应激组与对照组HSPA2、HSF2、HSF5、HSFY基因蛋白相对表达值未见统计学上的显著差异。2.小鼠精母细胞GC-2热应激模型研究结果2.1高温处理后3 h、6 h及12 h,热应激组HSPA2、HSF1、HSF2基因mRNA的相对表达值分别为（0.83±0.04、1.59±0.10、1.66±0.06）、（0.83±0.06、2.10±0.04、1.78±0.05）、（0.49±0.07、1.68±0.16、1.33±0.33）,蛋白的相对表达值分别为（0.87±0.14、0.88±0.03、0.93±0.07）、（0.84±0.19、1.23±0.10、1.27±0.03）、（0.66±0.12、0.54±0.08、1.03±0.12）;2.2相应对照组HSPA2、HSF1、HSF2基因mRNA的相对表达值分别为（0.94±0.05、0.92±0.07、0.83±0.15）、（0.98±0.08、1.10±0.13、0.96±0.12）、（0.93±0.21、0.99±0.03、0.92±0.24）,蛋白的相对表达值分别为（0.91±0.11、0.96±0.14、1.07±0.19）、（0.93±0.06、1.06±0.05、0.95±0.05）、（1.04±0.06、1.03±0.06、1.15±0.17）;2.3 HSPA2基因mRNA及其对应的HSPA2蛋白变化趋势基本相同,在高温处理后3 h及6 h,两者均无显著变化,但高温处理后12 h,两者表达水平均明显降低（P＜0.05）;2.4高温处理后3 h、6 h及12 h,HSF1基因mRNA的表达水平均见明显升高（P＜0.05）,而HSF1蛋白在高温处理后3 h及6 h均无显著变化,在高温处理后12 h,才观察到其表达水平明显降低（P＜0.05）;2.5 HSF2基因mRNA水平在高温处理后3 h及6 h,均有显著上升（P＜0.05）,但在高温处理后12 h,未见明显差异,HSF2蛋白仅在高温处理后6 h观察到明显上调（P＜0.05）,在高温处理后3 h及12 h均无显著变化。3.凝胶迁移实验EMSA结果阳性对照组23 bp DNA与重组人源HSF1及HSF2同源三聚体蛋白均能发生特异性结合,而实验组272 bp DNA与重组人源HSF1及HSF2同源三聚体蛋白均未能发生特异性结合。4.MSP和BSP实验结果MSP:无论是使用甲基化引物,还是非甲基化引物,热应激组和对照组都能成功扩增出目的DNA片段,在所研究的区域内,两组DNA样本均同时存在甲基化与非甲基化两种状态。BSP:热应激组和对照组各含20个有效单克隆,440个Cp G位点,其中热应激组发生甲基化的Cp G位点总数为6,对照组发生甲基化的Cp G位点总数为7,热应激组和对照组在BSP所扩增的目标DNA片段内,其甲基化率没有明显差异。研究结论1.大鼠生殖系统热应激模型研究结果表明,热应激可致大鼠睾丸中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5及HSFY基因mRNA表达显著下调,这很可能是热应激致精子发育功能障碍的潜在机制;2.小鼠精母细胞GC-2热应激模型研究结果表明,热应激下HSPA2、HSF1、HSF2基因表达均出现显著变化,HSPA2、HSF1、HSF2极可能在热应激过程中介导精子损伤的发生;3.预测的人HSPA2基因启动子可能不包含HSE序列;4.HSF1或HSF2单独存在时,可能无法与HSPA2基因启动子中的HSE序列相结合;5.热应激在短时间内导致HSPA2的表达下调,可能不是通过DNA的甲基化修饰来实现的。但限于本研究设计的不足,此结论还需进一步研究证实。