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目前,心血管疾病仍然威胁人类的健康,其中心肌梗死（myocardial infarction,MI）是最常见且最严重的类型之一,MI主要是因为心脏功能障碍最终导致心肌细胞不可逆的丢失、心室的不良重塑及心功能的衰退。尽管通过控制一些危险因素配合药物治疗以及支架干预治疗等方法取得了重要的进展,但主要的目的仍然是缓解和控制病情,而不能直接修复和再生受损的心肌,进而恢复心肌功能,因此,在组织工程中,干细胞成为心肌修复和再生的理想种子细胞。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是最常见的干细胞之一,由于BMSCs天然的生物学特性,对治疗MI具有一定的作用。5-氮胞苷（5-azacytidine,5-Aza）早在二十世纪就被公认为最重要的心源性诱导剂,它能够有效的诱导BMSCs向心肌方向分化,由于其重要的去甲基化作用,因此5-Aza一直是研究的热点。生物因素中的细胞因子类,骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP-2）属于转化生长因子β家族中的一员,对多种细胞的增殖、生存、分化和凋亡具有调节作用,除可以分化成为成骨细胞以外,在胚胎发育过程中,是心肌发育的一个关键上游信号。很多研究发现,尽管可以体外诱导BMSCs向心肌方向分化,但也存在心肌细胞增殖数量不足等问题。因此,除了多个因素联合诱导,基因治疗技术的进步对BMSCs的应用起到了推动的作用。目前,基因治疗中病毒载体的应用较为广泛,其中慢病毒载体则是其中最常应用的载体,与其它载体相比,其具有稳定长期表达、病毒滴度较高、细胞毒性较低和宿主类型广泛等特点。本实验主要构建慢病毒载体,将BMP-2基因通过过表达转染至BMSCs,探究过表达BMP-2基因诱导BMSCs分化为心肌样细胞的效率是否高于BMP-2直接诱导,同时探究过表达BMP-2基因联合5-Aza诱导BMSCs分化为心肌样细胞的效率是否高于其它单独诱导的效率。本实验采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs,流式细胞技术对其表面抗原进行鉴定,筛选BMP-2转染后诱导大鼠BMSCs最适浓度,免疫细胞化学、蛋白免疫印迹（Western blot）技术检测相关特异性蛋白的阳性表达,实时荧光定量PCR（RT-q PCR）法检测相关基因的表达效率;透射电镜（TEM）观察分化后的心肌样细胞的超微结构。显微镜下观察细胞的形态:培养72h后,细胞基本贴壁,一部分呈圆形并折射出亮光,另一部分伸展并呈短梭形;培养至1w后,细胞呈多样化形态,有梭形、菱形、多边形;培养至4w后,细胞紧密相接,具有方向性排列,呈放射状或旋涡状。流式细胞技术对第3代的BMSCs的表面抗原进行鉴定,结果显示:CD45,CD29,CD90的阳性表达率分别为1.4%,93.3%,95.1%,结果表明培养至第3代的细胞为纯化的BMSCs。在分组前,首先筛选通过构建慢病毒载体来过表达BMP-2基因诱导BMSCs的最适MOI值,预实验结果显示:Lenti-BMP-2-GFP慢病毒转染组最适MOI值为25,Lenti-对照-GFP慢病毒转染组最适MOI值为50。根据诱导剂的不同对培养至第3代的细胞进行分组实验:G1（空白对照组）、G2（BMP-2组）、G3（Lenti-BMP-2-GFP慢病毒转染组）、G4（Lenti-BMP-2-GFP慢病毒转染+5-Aza组）、G5（Lenti-对照-GFP慢病毒转染组）,BMP-2的终浓度为200ng·L-1,5-Aza的终浓度为10μmol·L-1。免疫细胞化学和免疫蛋白印迹（Western blot）技术检测结果显示:细胞培养至4w后,各诱导组均有心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T,c Tn T）、结蛋白（Desmin）、原肌球蛋白（tropomyosin,TPM）及间隙连接蛋白43（connexin 43,Cx43）的阳性表达,结果显示:各组均见c Tn T,Desmin,TPM and Cx43阳性表达,其中Lenti-BMP-2-GFP慢病毒转染+5-Aza组阳性表达率最高,差异具有统计学意义（P<0.05）。实时荧光定量PCR（RT-q PCR）法检测心肌早期转录因子GATA-4,Nkx2.5及心肌细胞增强因子2c（MEF2c）,各诱导组分别诱导时间为1w、2w及4w的表达情况,结果显示:GATA-4和Nkx2.5基因在各诱导组1w时开始表达,随后表达不断增强,4w时表达效率最强,Lenti-BMP-2-GFP慢病毒转染+5-Aza组在4w的表达最高,与1w和2w的表达相比差异具有统计学意义（P<0.05）,MEF2c基因在各诱导组1w时开始表达,2w时表达效率最高,2w后表达效率逐渐减弱,Lenti-BMP-2-GFP慢病毒转染+5-Aza组在2w的表达效率最高,与1w和4w的表达相比差异具有统计学意义（P<0.05）。透射电镜（TEM）观察结果显示:经Lenti-BMP-2-GFP慢病毒转染+5-Aza组诱导后的BMSCs细胞,细胞质内可见肌丝、线粒体、粗面内质网、核糖体等细胞器,具有与心肌细胞类似的超微结构。实验结果说明:（1）通过构建慢病毒载体过表达BMP-2来诱导BMSCs向心肌样细胞分化的效率高于BMP-2直接诱导。（2）过表达BMP-2基因联合5-Aza共同诱导BMSCs向心肌样细胞分化的效率高于过表达BMP-2直接诱导。