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长春花(Catharanthus roseus(L-)G.Don.)是夹竹桃科(Apocynaceae)长春花属的一种重要的药用植物。长春花生物碱长春碱(vinblastine)和长春新碱(vincristine)是由单体长春质碱和文多灵(vindoline)偶合而生成的,是目前应用最广泛的天然植物抗肿瘤药物。细胞悬浮培养物中不能合成文多灵是生物工程方法生产长春碱和长春新碱的瓶颈。脱乙酰氧基文多灵-4-羟化酶(desacetoxyvindoline-4-hydroxylase,D4H EC.1.14.11.11)是文多灵合成的关键酶。我们实验室应用抑制性差减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)筛选到长春花C20hi细胞系差异表达的基因片段,在此基础上,克隆了一个与d4h高度同源的基因d4h like,并对d4h和d4h-like基因的酶功能、转录表达特性、转录调控及其与生物碱合成的关系等方面进行了研究,结果如下:
1.克隆了长春花细胞的基因d4h-like的全长cDNA。根据抑制性差减杂交文库片断序列,通过RACE技术,克隆到的全长片断为1427 bp,其中ORF1116 bp,可编码372个氨基酸残基。序列对比表明,该基因与已报道的d4h基因在氨基酸水平具有66％的一致性和80％的相似性。它们都属于2.酮戊二酸依赖的二加氧酶超家族。氨基酸保守残基和活性位点、进化树分析、内含子与外显子的位置三个方面的证据均表明,d4h-like与d4h具有很高的同源性。
2.半定量RT-PCR实验对比研究了d4h和d4h-like基因转录表达特征。半定量RT-PCR实验结果显示:d4h-like基因在根中和C20hi悬浮培养细胞中表达量最高,茎和C20D次之,C20细胞微量表达,在叶片和花中不表达;d4h基因在叶片中表达量最高,茎次之,叶片和花中极微量表达,d4h基因在C20D悬浮培养细胞中微量表达,在C20hi和C20中几乎不表达。同时应用了LC-MS技术测定长春花不同组织的文多灵及其前体含量,讨论了生物碱合成与基因表达之间的相关性。
3.在光诱导实验中,d4h-like基因在每一个时间点都有表达;在未诱导组中,最大表达量出现在第36小时,而最小表达量出现在第8小时和第24小时。从第2到第8小时和从第12到第24小时有逐渐递减的趋势。受光诱导后,d4h-like基因表达量变化的周期同未诱导的对照组相似,说明在长春花细胞中d4h-like基因可能不受光信号的诱导。
4.利用原核表达系统表达并纯化出D4H-like和D4H两个水溶性的重组蛋白。构建了pRSET-D4HL和pET28-sumo-His-D4H原核表达载体,在大肠杆菌菌株BL21中成功表达出以水溶性形式存在的带有His-tag融合标签、分子量为44KD的D4H-Like重组蛋白和分子量为63KD的sumo-D4H融合蛋白,两个重组蛋白均经Ni-NTA亲和柱纯化出相应大小的目的蛋白。
5.基因组步行技术分别克隆了d4h-like和d4h基因的上游启动子序列。根据已知的cDNA序列设计引物,应用基因组步行法克隆获得d4h基因的上游905bp的序列(Genbank登录号为GU363551)和d4h-like上游2979bp的序列(Genbank登录号为GU363550)。序列分析发现d4h和d4h-like启动子包含有典型的启动子特征序列:TATA-box和CAAT-box,并带有应答光照、茉莉酸甲酯和真菌诱导子等外界信号以及维管组织特异表达等顺式作用元件。在d4h启动子中发现了一段与长春花特异的茉莉酸应答元件JERE相似的序列,推测该序列可能是与ORCA3相结合的一个顺式作用元件。
6.构建了d4h-like及d4h基因启动子片断调控GUS报告基因的植物表达载体。将克隆的d4h-like及d4h基因启动子的片断替换pCAMBIA1302-GuS载体中的CaMV35S启动子序列,构建成4个不同的植物表达载体,并用三亲杂交法将构建后的载体导入根癌农杆菌中。
7.瞬时表达实验检测启动子活性。以带有不同启动子调控GUS基因的植物表达载体的根癌农杆菌,侵染长春花细胞进行瞬时表达,检测GUS活性。结果显示:d4h-like基因上游的三个不同长度的启动子片段及d4h基因启动子序列均能调控GUS基因在长春花细胞中瞬时表达,表明所克隆的d4h-like及d4h基因启动子序列具有调控基因表达的活性。