本文主要研究双特异性抗体在免疫发光分析方法学领域的应用。利用苏丹红I作为模式分析物,分别采用异源双功能交联剂化学偶联法和杂交-杂交瘤细胞融合方法构建了两种抗苏丹红I/抗发光底物的双特异性抗体,利用构建的抗体可以同时特异性地与发光底物和苏丹红Ⅰ的结合特性,建立了基于该双特异性抗体的免疫发光分析方法。1.异源双功能交联剂化学偶联法构建双特异性抗体采用二硫苏糖醇（DTT）还原抗体重链与重链之间的二硫键形成游离的巯基,采用正交试验设计法优化反应条件,由实验结果得出:反应pH对重链与轻链（HC-LC）的产率影响最为显著,其次是温度和浓度,反应时间的影响次之。最优反应条件如下:pH为7⁸之间,浓度为1mg/mL,温度为25℃,时间2h,投料摩尔比例n（DTT）:n（IgG）为30⁷0。利用异源双功能交联剂4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC）先连接抗吖啶酯的单克隆抗体,后与还原二硫键的抗苏丹红I抗体进行偶联,经非还原SDS-PAGE检测,双特异性抗体偶联成功。2.杂交-杂交瘤细胞融合方法构建双特异性抗体采用8-氮鸟嘌呤（8-Ag）诱导分泌抗苏丹红I抗体的杂交瘤细胞,获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺陷株,将吖啶酯-血蓝蛋白抗原多次免疫Balb/C小鼠后取其脾细胞,与缺陷型苏丹红I的细胞株进行电融合。利用HAT进行筛选后,ELISA鉴定阳性的三瘤细胞,进行亚克隆后获得2株分泌抗苏丹红I/吖啶酯的双特异性抗体的三瘤细胞（G7/A5、A5/D11）。选择G7/A5注入小鼠腹腔内,大量产生抗苏丹红I/吖啶酯的双特异性抗体。经辛酸-硫酸铵的方法纯化G7/A5腹水后,采用戊二醛方法制备了抗苏丹红I/吖啶酯两种抗原免疫亲和柱,双免疫亲和柱纯化抗苏丹红I/吖啶酯的双特异性抗体,优化纯化的条件为:吖啶酯免疫抗原柱的缓冲液条件是pH7.0的0.01mol/L PBS,苏丹红I免疫抗原柱的最佳的缓冲液是pH6.5的0.01mol/L PBS,得到较纯的双特异性抗体。3.建立基于双特异性抗体的免疫发光分析法在杂交-杂交瘤细胞法获得的抗苏丹红I/吖啶酯的双特异性抗体的基础上,分别建立了化学标记免疫发光分析方法（CLIA）和酶联免疫发光（CLEIA）分析方法,结果表明CLEIA的稳定性和灵敏度等方面强于CLIA方法。在双特异性抗体的基础上选用竞争CLEIA方法建立了检测辣椒粉中的苏丹红I的免疫学检测方法。对CLEIA方法中的抗原抗体浓度、辣根过氧化物酶-吖啶酯（HRP-AE）浓度、有机溶剂含量、pH和离子强度等进行优化,经优化后,抗原的包被浓度是8μg/mL,抗体的稀释倍数为1:500,HRP-AE的稀释倍数为1:500,以30%的甲醇,0.01 mol/L PBS pH 6.4,离子强度NaCl为0mol/L作为缓冲条件。在优化条件下建立CLEIA间接竞争曲线,标准曲线方程是y=-45.974x+57.809,R2=0.9919,线性范围是0.2¹0ng/mL,IC₅₀为1.478 ng/mL。在辣椒粉样品中苏丹红I的加标回收率为71¹03%,变异系数为3.1⁴.7%。