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为了解网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis Virus,REV)流行野毒株囊膜糖蛋白基因(env)的变异情况,利用经细胞培养、间接荧光抗体试验和PCR扩增的方法从我国1999—2004年间不同省份的鸡场所采集样品中分离和鉴定的REV野毒株及国外分离株,以一对特异性引物对其env基因进行PCR扩增后再克隆、测序,并用DNAstar软件与已发表env基因的序列进行同源性比较分析。结果表明除缺陷致瘤T株的增殖辅助病毒A株可能由于历史的原因而与其它株相差较大外,参与比较的其它各env基因序列相对比较保守,在核苷酸水平或氨基酸水平的同源性都在92%以上,其间仅有6个碱基或2个氨基酸的差异。这种差异在env基因的局部则更加明显,且在不同毒株间呈现一定的规律性,但与各毒株的分离年代、分离地域没有明显的相关性。另外,在env基因序列上发生变异的集中区段,经计算其各自的NS/S值,都明显高于用以判断病原在某种选择压作用下相应基因发生变异的公认值2.0。这表明参与比较的REV各毒株由最初原始毒分支进化过程中,即在与宿主长期的适应性斗争中,其env基因明显地受到宿主免疫系统的优势筛选作用,从而表现出变异的一致性。 鉴于自然分离野毒株在病原学上仍属于一庞杂的群体,这将影响到对其继后研究分析的严谨性和精确性。而要达此效果,只有将最初分离病毒群中占优势的病毒粒子纯化出来,构建遗传背景清楚的病毒模型,从而使继后的研究排除偶然性的干扰,便于研究结果的分析、推理。在此意义上,本文以REV中国分离株HA9901为样本,以6对相互连续且部分重叠的引物对其前病毒cDNA进行PCR扩增克隆和测序,从而完成了其前病毒cDNA全基因组核苷酸序列,这也是第一个以鸡源游离的感染性完整病毒粒子完成的REV全基因组序列。将此序列与已知的其它REV毒株全基因组序列相比较的结果表明,REV的整个基因组相当保守,不同毒株相间的同源性都较高,尤其编码功能蛋白的pol基因序列更是完全相同。但在REV增殖过程中发挥重要作用的LTR序列,则因分离宿主的不同而有两处显著的差异,只是这一差异的意义还有待进一步求证。 为验证HA9901全基因组序列的正确性,在其编码gp30和env基因的相应序列上选取引物,经PCR扩增及继后的定向克隆,将二者分别克隆入表达载体pGEX-6P-1或pcDNA3.1/Zeo(+)中。各克隆质粒分别经转化表达宿主菌E.coli.BL21或经