家蚕（Bombyx mori）是我国一种重要的经济昆虫,其吐出的蚕丝具有很高的经济价值,在服饰、医疗和化妆品等方面都有广泛的用途。然而,家蚕杆状病毒容易感染家蚕,引起家蚕群体爆发烈性传染病,导致大量的家蚕死亡并显著减少蚕茧产量,给蚕桑经济带来极大的损失。本课题组前期研究发现:家蚕杆状病毒Bm65蛋白在病毒感染早期表达,其分子量大约为12.2 kDa。Bm65主要分布于细胞核中,与紫外线引起的DNA损伤修复有关,但Bm65蛋白入核机制仍不甚清楚。本论文通过对Bm65蛋白序列中的几个功能序列进行鉴定,阐明它们在Bm65蛋白入核中的作用及其对病毒增殖的影响,为进一步改造并利用杆状病毒提供理论依据。本论文研究的主要结果如下:1.通过对Bm65蛋白序列及其同源序列进行分析,发现³³RRIK和⁷⁶KRKCSK及其C端两个疏水氨基酸簇⁹²PLLL和⁹⁸FLLA高度保守,推测与Bm65蛋白在核质中的动态转运有关。2.构建了一系列在ie1启动子控制下,并与EGFP融合的Bm65截短突变瞬时表达载体,通过荧光信号研究Bm65的分布,发现⁷⁶KRKCSK与Bm65的核输入有关,而³³RRIK不直接参与Bm65的核输入。为了进一步验证该结果,作者构建Bm65突变体,将其与EGFP融合表达,荧光观察发现:³³RRIK突变体与野生型Bm65定位一样,而⁷⁶KRKCSK序列突变后,Bm65蛋白入核受阻,主要累积在细胞质中,说明⁷⁶KRKCSK在Bm65入核中起重要作用。作者通过对其进行单点突变,发现78K和81K是⁷⁶KRKCSK序列中起关键作用的氨基酸残基。3.Bm65截短突变体的瞬时表达表明⁹²PLLLHKFLL可能与Bm65的核输出有关。为了鉴定⁹²PLLLHKFLL是否为Bm65蛋白的出核信号,分别将该序列中的两段疏水氨基酸进行突变,并与EGFP融合构建瞬时表达载体,通过观察荧光信号的分布可知:⁹²PLLL和⁹⁸FLLA序列分别突变后,Bm65蛋白全部聚集在细胞核中,在细胞质中几乎看不到绿色荧光,因此,我们认为⁹²PLLL和⁹⁸FLLA两段序列发挥Bm65蛋白出核信号的作用。4.构建融合Flag标签的Bm65重组病毒,对病毒感染的BmN细胞总蛋白进行Western blot分析,发现Bm65在病毒感染的细胞中以四聚体的形式存在;作者将Bm65序列中三个半胱氨酸残基C12、C46和C79同时突变为丙氨酸,Western blot分析发现:这些突变并没有改变Bm65的四聚体形式,但影响了Bm65四聚体的稳定性。另外,将EGFP标签融合在Bm65蛋白的C端或N端,发现该融合蛋白表达均以单体的形式存在,说明融合EGFP序列标签会影响Bm65四聚体的形成。5.⁷⁶KRKCSK序列突变导致Bm65入核受阻,并不影响Bm65四聚体的形成,但极大地降低了子代感染性病毒粒子的产量。该突变病毒皮下注射家蚕后,与野生型病毒相比,其在家蚕体内的增殖效率也明显降低,延缓了家蚕致病或致死。