论文部分内容阅读
冠状动脉微栓塞（Coronary Microembolization,CME）是由自发或医源性原因引起冠状动脉内的粥状斑块破裂,细斑块屑以及继发的血栓,沿血流到达微循环系统（微动脉、毛细血管、微静脉）,引起冠状动脉微循环障碍。广泛存在的冠脉微循环障碍显著削弱了急性心肌梗死（acute myocardium infarction,AMI）患者急诊介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI）后的获益,是患者早期并发症、远期心力衰竭和死亡的重要原因。无复流是CME常见临床表现,通过血液中肌酸激酶和肌钙蛋白的变化可以间接提示CME对心肌的损害,冠状动脉内多普勒则可以直接观察到微栓塞,而心脏核磁共振则可进一步明确栓塞的部位及梗死的区域。抗血小板药物、他汀类药物、血栓抽吸装置等措施可以减少CME发生,但临床实践中尚未完全建立避免冠状动脉微栓塞和从微血管阻塞中拯救心肌的心脏保护策略。AMI患者的无复流现象最高仍可达到30%,如何有效防治CME是心血管医生面临的难题,深入其损伤机制研究,以及以后的医学转换,是科研工作者多年来关注的问题。最初通过TUNEL染色和cleaved-caspase3免疫组化检测CME动物模型心肌组织,发现心肌细胞凋亡现象的存在于CME中,之后包括本课题组在内的多个研究团队的深入研究表明:凋亡是CME致心肌损伤的最重要机制之一。线粒体凋亡通路属于凋亡机制的内部途径,近年来HtrA2作为线粒体凋亡通路中的新发现的关键分子在各个领域倍受关注。HtrA2是线粒体膜间隙里的丝氨酸蛋白酶,在线粒体质量控制和维持线粒体稳态中起重要作用,并可以通过双重途径促进细胞凋亡。近期有研究表明,急性心肌梗死PCI患者血清HtrA2增高与缺血再灌注损伤有关,但与导致再灌注损伤中的何种类型有关,未进一步阐明。临床研究观察线粒体ATP敏感型钾通道激活剂——尼可地尔改善无复流现象,结合我们前期研究表明其抑制心肌凋亡线粒体上游通路,而HtrA2调控的下游通路是否受到尼可地尔抑制,尚无相关报道。据此,本课题拟观察急性心肌梗死PCI患者外周血HtrA2变化规律与无复流的相关性,探索其临床价值。构建CME大鼠模型,观察CME后HtrA2变化规律,探讨HtrA2调控的凋亡在CME致心肌损伤的作用。探索HtrA2/XIAP/PARP通路在尼可地尔心肌改善CME心肌损伤的作用。第一部分外周血HtrA2在急性心肌梗死患者中的表达及临床意义研究研究目的1.观察急性心肌梗死PCI患者外周血HtrA2的变化情况2.探索外周血HtrA2与无复流的关系研究方法连续收集本院急性心肌梗死（AMI组）,稳定型冠心病（Stable-CAD组）及健康志愿者（Health-Control组）病例。若PCI时,患者冠脉血流未恢复,出现无复流（TIMI 0-2级）入组NF亚组,冠脉血流TIMI 3级的AMI为NNF亚组。急性心肌梗死患者于发病24小时内、72小时、7天分别采集血样,稳定冠心病患者入院24小时内采集,志愿者在确认为健康状态后采集。用EDTA抗凝管采集每位受试者血样3ml,收集后以4℃1200 x g离心15分钟,并在-80℃冰箱储存样品。用ELISA法检测血浆中HtrA2浓度。用SPSS软件分析数据,比较各组浓度差异,观察AMI组浓度变化规律,Pearson相关分析HtrA2与心肌损伤标志物CK-MB、LDH、肌钙蛋白的相关性,Logistics回归分析HtrA2表达水平与AMI、NF的相关性,ROC曲线用于推断ROC曲线下的面积。研究结果1.共入选37例研究对象,AMI组20例,除1例为非ST抬高型心肌梗死外,其余均为ST抬高型心肌梗死,均行急诊PCI。AMI中出现无复流CME组7例。Stable-CAD组7例,Health-Control组10例。AMI组、Stable-CAD组、Health-Control组三组间的性别、糖尿病史、血脂异常、冠心病家族史血压、体重指数、血清肌酐、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇没有统计学差异（P≥0.05）。冠心病组内比较,年龄、高血压病史、主要使用药物没有统计学差异（P≥0.05）,AMI组患者LVEF较低（P<0.05）。与其他组比较,AMI组患者发病24小时内白细胞总数、中性粒细胞绝对、超敏C反应蛋白更高（P<0.05）,而淋巴细胞绝对值、高密度脂蛋白胆固醇的值更低（P<0.05）。2.血浆HtrA2-24h浓度在AMI组、Stable-CAD组、Health-Control组,分别为2018.13（702.41,2781.57）pg/ml、622.19（359.54,882.182）pg/ml、722.87（343.16,895.49）pg/ml,与其他两组比较,AMI组明显增高（P<0.05）,而Stable CAD组、Health-Control组的HtrA2浓度无显著差异。AMI患者PCI后,HtrA2呈逐渐下降趋势。AMI患者PCI后,血浆HtrA2逐渐下降趋势,发病24h和72h浓度没有统计学差异,7d浓度明显下降（P<0.05）。3.AMI亚组NF组、NNF组的血浆HtrA2-24h浓度分别为2781.57（2203.66,4600.02）pg/ml、1808.15（620.124,2016.52）pg/ml,两者有显著差异（P<0.05）。AMI患者PCI后,血浆HtrA2及各种心肌损伤标志物均呈逐渐下降趋势。NF组与NNF组均也呈下降趋势,但NF组24h、72h血浆HtrA2浓度均比NNF组高（P<0.05）4.患者入院24小时内的HtrA2表达水平与CK-MB、LDH、CTn T、CTn I呈正相关（P<0.001）,与Pro BNP无明显相关。5.根据诊断分组,以AMI为因变量,24h内的HtrA2为自变量做Logistic回归,HtrA2与AMI有显著正相关（P<0.05）。在冠心病人群中,以HtrA2为检验变量,AMI为状态变量,血浆HtrA2诊断AMI的ROC曲线下面积为0.895（P<0.05）。在所有人群中,以HtrA2为检验变量,AMI为状态变量,做ROC曲线,曲线下面积为0.864（P<0.05）。6.将AMI患者24h血浆HtrA2浓度根据中位数2018.13pg/ml,将患者分为两组。各项基线资料无统计学差异。以NF为因变量,以24h内的HtrA2为自变量做Logistic回归,HtrA2与NF有显著正相关（P<0.05）。在AMI中,以24h血浆HtrA2为检验变量,NF为状态变量,血浆HtrA2诊断NF的ROC曲线下面积为0.912（P<0.05）。研究结论1.AMI急诊PCI患者外周血HtrA2明显增高,24小时后逐渐下降,无复流患者在24h、72h高于非无复流患者;2.血浆HtrA2与心肌损伤标志物成正相关,与CK-MB的相关性最高;3.血浆HtrA2与无复流呈正相关第二部分HtrA2/XIAP/PARP线粒体凋亡通路介导冠状动脉微栓塞大鼠心肌损伤的机制研究研究目的1.探究HtrA2在大鼠CME模型的表达水平;2.探究HtrA2/XIAP/PARP调控的凋亡对CME致心肌损伤的作用。研究方法1.观察CME模型的心肌受损变化趋势:用随机法,将SD大鼠分为假手术组（Sham组）和冠状动脉微栓塞组（CME组）,Sham组10例,CME组50例,再根据不同观察时间点将CME组分为3h、6h、9h、12h、24h亚组,平均每组10例。造模后,先用心脏超声在相应时间点测量心功能,然后取心肌组织做HE染色观察微栓塞球,而HBFP染色则观察心肌微梗死灶并测梗死面积。2.探索HtrA2在CME模型中的作用及机制:用随机法,将SD大鼠分为四组,分别为:假手术组（Sham组）、微栓塞组（CME组）、溶剂对照组（CME+DMSO组）、HtrA2抑制组（CME+UCF101组）,平均每组10例。结合上节结果,以CME造模后心功能损伤最严重的时间点作为本节所有组别测量心功能及取材时间。比较心功能、心肌梗死面积、TUNEL染色、凋亡和通路相关蛋白的变化。研究结果1.各时间亚组心脏超声提示:与Sham组比较,CME组的心功能从3h开始下降,CME 9h为最低值,具体表现为LVEDs、LVIDd增加、LVEF、LVFS、CO下降,P<0.05。2.HE染色和HBFP染色提示:除Sham组外,其余各组HE染色中可见透明的聚乙烯微球阻塞在微血管内,微栓塞球周围见小灶状心肌梗死表现,表现为肌浆凝聚,深红色,细胞核固缩、甚至碎裂至溶解消失,梗死灶第二部分HtrA2/XIAP/PARP线粒体凋亡通路介导冠状动脉微栓塞大鼠心肌损伤的机制研究周围有大量炎性细胞聚集。HBFP染色正常心肌呈黄染,微梗死区的心肌呈红染,切片内见多发微梗死灶。3.Western-blot提示:CME组与Sham组比较,其心肌组织细胞浆内HtrA2表达水平显著增高,线粒体HtrA2表达减少,P<0.05。4.超声心动图（造模后9h）提示:CME+UCF101组与CME组比较,其超声心动图参数LVEF、LVFS、CO上升,同时LVIDd、LVIDs下降,提示大鼠心脏功能受损程度下降（P<0.05）,而CME+DMSO组大鼠心功能与CME组比较无明显变化。5.HBFP染色（造模后9h）示:CME组、CME+DMSO组、CME+UCF101组心肌组织微梗死面积百分比分别为18.21±3.41、19.08±3.14、9.74±2.36。CME+UCF101组与CME组比较,其心肌微梗死面积显著减少（P<0.05）;CME+DMSO组与CME组比较,其心肌组织微梗死面积无明显变化。6.血清生化检测（造模后9h）示:与Sham组比较,CME组的CK-MB、LDH增高,P<0.001;与CME组比较,CME+UCF101组CK-MB、LDH较低,P<0.05,CME+DMSO组的CK-MB、LDH没有差异。7.心肌TUNEL凋亡染色（造模后9h）显示:Sham组、CME组、CME+DMSO组,CME+UCF101组微梗死灶区心肌细胞凋亡率（%）分别为1.67±0.68、26.54±1.87、27.56±2.46、19.30±1.95,CME组与Sham组比较,其微梗死灶区心肌细胞凋亡指数显著增加（P<0.05）;CME+UCF101组与CME组相比较,其微梗死灶区心肌细胞凋亡指数显著减少（P<0.05）;CME+DMSO组与CME组相比较,其凋亡率无显著差异。8.凋亡相关蛋白表达（造模后9h）显示:CME组与Sham组比较,其C-caspase3、C-caspase9、Cytochrome C蛋白表达水平显著增加（P<0.05）;CME+UCF101组与CME组相比较,蛋白C-caspase3、C-caspase9、Cytochrome C的表达水平减少（P<0.05）;CME+DMSO组与CME组比较,蛋白C-caspase3、C-caspase9、Cytochrome C表达没有显著差异。9.各组HtrA2/XIAP/PARP通路蛋白表达（造模后9h）显示:与Sham组比较,CME组HtrA2胞浆蛋白、C-PARP蛋白相对表达水平显著增加,同时XIPA蛋白相对表达显著减少（均P<0.05）;与CME组比较,CME+UCF101组的HtrA2胞浆蛋白、蛋白C-PARP表达减少,蛋白XIPA的表达增加（均P<0.05）;CME+DMSO组与CME组相比较,蛋白C-PARP、蛋白XIPA和蛋白HtrA2胞浆内的相对表达没有显著差异。研究结论1.大鼠CME模型从3h后心功能进行性下降,CME9h最低。2.CME时HtrA2从线粒体移位至胞浆,HtrA2在CME心肌细胞胞浆表达升高。3.HtrA2参与的凋亡致CME心肌损伤,抑制HtrA2活性可减少凋亡从而改善CME引起的心脏结构和功能的改变。4.HtrA2可能通过HtrA2/XIAP/PARP途径介导细胞凋亡而促进CME的心肌损伤。第三部分HtrA2/XIAP/PARP通路在线粒体KATP激活剂改善冠状动脉微栓塞心肌损伤中的作用研究目的1.观察HtrA2在线粒体KATP激活剂——尼可地尔作用下的变化2.探讨HtrA2/XIAP/PARP在线粒体KATP激活剂影响下对CME的作用研究方法采用随机化的原则,将8周龄SD大鼠分为四组,每组10只,假手术组（Sham组）,冠脉微栓塞组（CME组）,尼可地尔组（CME+NIC组）,HtrA2抑制组（CME+UCF组）。CME+NIC组在CME造模前10分钟,按5mg/kg的量给予腹腔注射尼可地尔溶液。CME+UCF组,在CME造模前10分钟按1.5umol/Kg的量给予腹腔注射UCF101。造模后9h测定超声心动图,腹主动脉取血,取心脏组织分别进行HE染色、TUNEL染色、WB蛋白检测、透射电镜扫描进行检测。研究结果1.超声心动图检测结果显示:与CME组比较,CME+NIC组LVEDs（3.36±0.35 vs.4.39±0.55）mm、LVIDd（5.92±0.39 vs.6.67±0.45）mm减小,LVEF（76.35±5.96 vs.67.62±9.32）%、LVFS（43.05±5.63 vs.32.95±5.74）、CO上升（0.20±0.03 vs.0.13±0.01）（L/min）（P<0.05）;与CME组比较,CME+UCF组的LVEDs、LVIDd减小,而LVEF、LVFS、CO上升（P<0.001）。2.血清生化检测示:与Sham组比较CME组的CK-MB、LDH增高,差异显著P<0.001;与CME组比较,CME+NIC组、CME+UCF的CK-MB、LDH显著下降P0.05。3.透射电镜示:Sham组大鼠心肌细胞的肌原纤维结构较清晰,细胞器线粒体的膜基本完整;CME组内可见细胞器线粒体明显肿胀、线粒体脊断裂;CME+NIC、CME+UCF组线粒体结构尚清,线粒体轻度肿胀、无明显线粒体脊断裂。4.TUNEL凋亡染色结果显示,Sham组、CME组、CME+NIC组、CME+UCF组心肌细胞凋亡率（%）分别为1.56±0.78、25.34±1.45、17.55±1.96、19.32±1.94;CME组与Sham组相比较,其微梗死区的心肌细胞凋亡率增加显著（P<0.001）;与CME组比较,CME+NIC组、CME+UCF微梗死灶区心肌细胞凋亡率减少（P<0.00）;CME+NIC组与CME+UCF组比较,凋亡未见统计学差异（P≥0.05）5.Western-blot检测胞浆内HtrA2表达:CME组与sham组比较,其胞浆HtrA2表达增加（P≤0.05）;与CME组比较,CME+NIC组、CME+UCF组胞浆HtrA2表达均下降（P≤0.05）6.Western-blot检测凋亡相关蛋白表达:CME组与Sham组相比较,蛋白C-caspase3、蛋白C-caspase9、蛋白Bax的表达显著增加,同时蛋白Bcl-2表达显著减少（P<0.05）;与CME组相比较,CME+NIC组、CME+UCF组的蛋白C-caspase3、C-caspase9、Bax表达有减少,蛋白Bcl-2表达增加（P<0.05）;CME+NIC组与CME+UCF组比较蛋白C-caspase3、C-caspase9、Bax、Bcl-2表达没有显著差异。7.Western-blot检测HtrA2/XIAP/PARP通路蛋白表达:CME组与Sham组相较,其XIPA蛋白表达有显著减少,而C-PARP蛋白表达则显著增加（P<0.05）;与CME组比较,CME+NIC组、CME+UCF组的XIPA蛋白相对表达增加,C-PARP蛋白相对表达减少（P<0.05）;CME+NIC组与CME+UCF组相较C-PARP、XIPA蛋白表达没有显著差异。研究结论1.尼可地尔减轻对CME所致心肌损伤,减轻心肌线粒体损伤,改善心肌功能;2.HtrA2/XIAP/PARP信号通路可能介导尼可地尔减少CME致凋亡作用。