PCV2d VLPs在小鼠淋巴结中的动力学研究

来源 :湖南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chifelonh
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病毒样颗粒(Virus-like Particles)的应用起始于人类疫苗的研发,归功于其安全性和有效性,经过几十年的研究,VLPs早已成为各大疫苗研发平台的研究对象。VLP技术的范围不仅体现在疫苗的开发上,而且还体现在药物的传递、材料、生物催化应用上。VLPs为药物递送提供了几个关键优势:1.高效的药物递送比率;2.均一的自组装;3.人工修饰使其功能灵活化;4.大小和形状多种多样;5.毒性低,生物相容性好。本研究首先从湖南省长沙、岳阳、株洲等9地送检病猪共计108份病料中分离抗原性强的毒株。通过对这108份病料进行DNA提取和PCV2 cap基因的PCR检测,结果表明PCV2阳性病料有57份,PCV2检出率为52.7%。对57份PCV2阳性病料中的15份强阳性病料的PCV2全长基因进行测序,得到PCV2a 3份(17.6%)、PCV2b 5份(38.4%)、PCV2d 7份(53.8%)。对5份PCV2b,7份PCV2d进行病毒分离,并得到一株无其他病原体污染的PCV2b(KU317482),一株无其他病源污染的PCV2d(MH718995),病毒滴度分别达到105.5 TCID50/ml和105.66 TCID50/ml。然后利用流行性较为广泛的PCV2d的cap基因和pET100构建表达载体pET100-H,并利用大肠杆菌表达系统表达PCV2 Cap蛋白,Ni柱纯化后经SDS-PAGE验证并进行PCV2 VLPs的组装,组装产物经透射电镜验证,颗粒直径大小约为17nm的颗粒;经排阻色谱法和间接免疫荧光鉴定为PCV2 VLPs。最后探究PCV2 VLPs在小鼠腘淋巴结中的动力学。足底皮下注射PCV2 VLPs后在规定时间点处死小鼠,取腘淋巴结和腹股沟淋巴结做冰冻切片,用免疫荧光的方法研究VLPs在淋巴结中的动力学。结果显示:1.免疫后PCV2d VLPs以3000μm/min的最大速度,通过自由扩散从足底到达淋巴结;2.PCV2 VLPs分为两部分先后进入膝后窝淋巴结。第一部分PCV2 VLPs通过自由扩散在免疫后5分钟就在膝后窝淋巴结中被检测到,大部分抗原通过导管进入髓质区,小部分抗原通过与非特异性B细胞互作被运输到滤泡内,随着时间的推移VLPs从淋巴结被膜下窦进入浅皮质区并与B细胞共定位,在12h时,自由扩散方式停止,第一部分抗原在髓质区的信号减弱;6h时第二部分抗原通过树突状细胞携带进入淋巴结;3.PCV2 VLPs 1d内活化特异性的B细胞和T细胞。大部分抗原被树突状细胞识别并运输到B细胞和T细胞交界处,小部分抗原经导管被运输到髓质区;4.免疫后第4天第一次观察到初始生发中心的形成,并经过3天的增殖,终形成完整的生发中心,并在生发中心明区发现大量VLPs信号;生发中心反应维持2周后停止,第28天时PCV2 VLPs依旧存在于膝后窝淋巴结皮质区;5.PCV2VLPs未进入腹股沟淋巴结。在腹股沟淋巴结中未检测到PCV2d VLPs的信号。本研究的结果为基于PCV2d VLPs研发的疫苗以及以其为药物载体的研究提供了实验基础。
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