一研究背景及目的由创伤、骨关节炎等引起的关节软骨病损是骨科常见疾患，已成为导致中老年人残疾的主要原因。局限于软骨浅层的缺损，依靠软骨细胞有限的分裂能力仅有微小的内源性修复或难以修复；全层关节软骨缺损，由骨髓迁徙来的间充质干细胞分化为软骨细胞，形成的新生修复组织介于纤维软骨和透明软骨之间，其性能难与正常软骨相比，逐渐出现退变。近年来探索应用于临床的许多方法，如钻孔术、关节镜下磨削及灌洗术、自体或异体组织(骨膜、软骨膜、骨软骨块等)移植、细胞(软骨细胞或间充质干细胞)移植等，虽在近期能获得症状的改善，但未能使受损的软骨在形态学、生化和生物力学方面恢复至正常，修复组织不能达到良好的远期疗效，常在短期内发生退变。诸多尝试说明在接受关节置换之前尚无公认的有效手段。组织工程技术可以通过获取自体或异体少量组织细胞，在某些细胞因子的作用下，经体外培养扩增后与支架材料复合，构建与病损区形状结构、生物学特性相近的细胞—支架复合体，以修复或替代损伤组织。以自体软骨细胞为种子细胞，存在来源有限，体外多次传代培养易使细胞发生“去分化”，丧失分泌软骨基质的能力，因此难以用少量自体组织经培养获得大量有正常功能的软骨细胞。干细胞如胚胎干细胞和骨髓基质干细胞具有很强的分裂增殖能力及多向分化潜能，在一定条件下可以分化为软骨细胞，但体外培养条件下如何诱导干细胞向软骨细胞表型分化，以及如何维持软骨细胞表型稳定等目前尚未明确。同种异体软骨细胞具有来源广泛，可以一次性获取大量细胞等优点，在三维立体培养环境下可保持软骨细胞分化特性，根据以往实验证实异体软骨细胞移植不发生严重免疫排斥反应，显示同种异体软骨细胞可以作为软骨组织工程的种子细胞。 理想的支架对于成功构建组织工程软骨也至关重要。天然材料具有良好的细胞和组织相容性，但因初始机械力学强度不足现已较少使用，人工材料具有易加工、降解速率可调节、力学性能好、来源稳定等优点，但是一般人工合成的可降解材料具有较强疏水性的表面，而且其表面缺乏细胞可以识别的位点，因而普遍不具有良好的细胞相容性。将天然材料与人工材料以一定的方式结合起来，制成合成的多孔支架，以使两者的优点相结合，可望制得较理想的软骨组织工程支架。 为成功构建工程软骨，需要促进软骨细胞的增殖、维持细胞的表型、增进胞外基质的合成，已证实有多种细胞因子如TGF-β、bFGF、IGF、HGF等能促进软骨形成或刺激细胞增殖。近年来BMP7被发现能维持软骨细胞的表型，诱导软骨细胞外基质如蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成，并抑制由白介素-1(interleukin-1，IL-1)介导的软骨基质分解代谢。BMP7还能使体外培养中已经表现反分化的软骨细胞恢复表型，重新表达软骨细胞特异性物质。但外源性BMP7来源有限、半衰期短，易被创伤局部的蛋白酶所水解，且治疗剂量相对较大，有可能导致毒性作用的产生限制了其应用。采用转基因技术将BMP7因子的cDNA转染软骨细胞，可使之在体内一定时间内持续表达内源性BMP7，以维持软骨细胞的成软骨生物学性状。 本实验研究拟选用幼兔的关节软骨细胞为种子细胞，在体外不同培养条件下观察软骨细胞的生物学性状变化；通过构建携带重组人BMP7cDNA的质粒DNA，转染体外培养扩增的软骨细胞；同时采用Ⅰ型胶原和羟基磷灰石复合，构建柱状分层的支架；将软骨细胞种植其中培养，构建小型组织工程软骨复合体，观察植入动物体内修复膝关节软骨缺损的转归。 二实验方法与结果第一部分不同培养条件下软骨细胞生物学性状的变化方法：Ⅰ型胶原支架通过以下步骤制作：将EDC按比例加入Ⅰ型胶原溶液中混合，倒入制作好的模具内，4℃静置24h，-80℃冷冻1h后脱模，再在冷冻干燥机中处理12h，得到Ⅰ型胶原支架。应用序列酶消化法自2周龄新西兰大白兔膝关节软骨组织中分离软骨细胞，单层培养扩增。通过细胞生长曲线的测定，流式细胞仪检测细胞DNA周期，透射电镜检测，以及Ⅱ型胶原、S-100免疫组化染色检测软骨细胞在体外单层培养条件下的生物学性状变化；将生长状态良好的第2代细胞消化离心，接种于Ⅰ型胶原支架三维立体培养3周，经相差倒置显微镜、扫描电镜、组织学和免疫组织化学检测软骨细胞在胶原支架中三维立体培养条件下的生物学性状变化。 结果：体外单层培养的软骨细胞呈三角或多角形，胞核大而圆，3代以前增殖速度快。随着传代次数的增加，增殖速度减慢，传6代以后，细胞分裂能力明显下降，细胞变形明显，体积变大，表现出细胞老化和向成纤维细胞反分化的趋势。第2代细胞Ⅱ型胶原、S-100免疫组化染色胞浆内呈阳性反应，至第6代细胞Ⅱ型胶原、S-100免疫组化染色阴性。流式细胞仪检测显示第2代细胞处于S/G2M期细胞的比例比第6代细胞明显高，说明传代6代后细胞分裂增殖明显减慢。透射电镜检查第3代细胞核仁大，染色质丰富，细胞内可见大量的粗面内质网、线粒体，第6代细胞出现空泡变性。软骨细胞在Ⅰ型胶原支架表面呈长梭形，在支架内部细胞聚集成团，呈圆形或卵圆形，细胞团中有基质分泌，沉积于细胞周围，部分区域形成类似于软骨陷窝样结构，Ⅱ型胶原免疫组化染色示胞浆内阳性反应。扫描电镜观察可见细胞成团地吸附于支架表面及孔隙侧壁，并可见细胞间通过突起相互连接，或伸出伪足贴附于支架孔隙壁上。 第二部分重组人BMP7质粒的构建及转染软骨细胞后的表达方法：构建重组人BMP7真核表达质粒pcDNA3.1-rhBMP7，经酶切和测序鉴定。在转染试剂Effectene的介导下转染软骨细胞，转染后培养液中加入G418筛选，通过逆转录PCR和实时荧光定量PCR检测BMP7基因转染软骨细胞后的瞬时表达，采用G418筛选和免疫组化染色检测BMP7基因转染软骨细胞后的稳定表达。MTT法和S-100免疫组化检测BMP7基因转染对软骨细胞生物学性状的影响。结果：构建的真核表达质粒pcDNA3.1-rhBMP7经酶切PCR及DNA测序证实。pcDNA3.1-BMP7转染软骨细胞经G418筛选，未得到转染的细胞逐渐凋亡，转染细胞长成细胞克隆，经逆转录PCR检测，扩增得到了相应的DNA片段，而未经转染的细胞则明显表达较弱，实时荧光定量PCR检测BMP7基因拷贝数在转染后软骨细胞和未转染的软骨细胞之间有显著差异，证明rhBMP7基因转染软骨细胞后其BMP7表达水平有明显变化。MTT法检测证实rhBMP7基因转染软骨细胞的表达产物对细胞的增殖有促进作用，S-100免疫组化检测转染细胞呈阳性反应，未转染软骨细胞为阴性。 第三部分Ⅰ型胶原/羟基磷灰石柱状分层支架的构建及与软骨细胞的体外相容性观察 方法：Ⅰ型胶原/HA分层支架按以下步骤制备：将Ⅰ型胶原溶液加入分散的HA溶液中搅拌混合，加入EDC。调配形成不同比例的胶原-HA复合物，逐层加入模具，4℃静置24h，放入-80℃过夜，再在冷冻干燥机中干燥12h后取出即可。选择生长状态良好的第2、3代软骨细胞消化离心，接种于Ⅰ型胶原/HA支架，经相差倒置显微镜、扫描电镜、组织学和免疫组织化学检测软骨细胞与支架的相容性。 结果：Ⅰ型胶原/HA为具有一定机械强度的柱状分层的三维多孔支架，最上层为纯胶原，底层为纯HA，中间为胶原与HA复合。扫描电镜观察，支架表面为纯胶原，具有不规则的通孔结构，孔径较均匀且相互连通，中间层为多孔的Ⅰ型胶原/HA复合。支架表面细胞数量较多，多数呈长梭形，支架内部细胞聚集成团，呈圆形或卵圆形，细胞团中有基质分泌，沉积于细胞周围，部分区域形成类似于软骨陷窝样结构，靠近支架底部细胞很少。Ⅱ型胶原免疫组化染色示胞浆内阳性反应。扫描电镜观察可见细胞成团地吸附于支架表面及孔隙侧壁，并可见细胞间通过突起相互连接，或伸出伪足贴附于支架孔隙壁上。 第四部分转基因组织工程软骨移植修复兔膝关节软骨全层缺损方法：体外分离培养2周龄新西兰大白兔关节软骨细胞，部分细胞进行重组人BMP7基因转染，将两种细胞分别种植于Ⅰ型胶原/HA支架构建工程软骨复合体。在30只兔膝关节股骨髁或股骨滑车作一直径3.5mm、深约3-4mm的软骨缺损。分4组处理，即缺损旷置、单纯支架植入、软骨细胞+支架复合体植入、rhBMP7基因转染软骨细胞+支架复合体植入，分别于术后4、8、12、16周取材，进行大体观察、组织学检查和病理评分。 结论通过本实验研究，得出以下结论：1.软骨细胞在体外单层培养会发生去分化现象，失去细胞表型，高密度培养能减缓该过程，在Ⅰ型胶原支架中三维立体培养有利于维持其细胞表型及功能。2.外源性重组人BMP7基因转染软骨细胞可以获得高效表达，其表达产物具有一定的维持软骨细胞表型及促进软骨细胞增殖的作用，为软骨组织工程的研究提供了改良的种子细胞。 3.具有柱状分层结构的Ⅰ型胶原/羟基磷灰石复合支架与软骨细胞相容性良好，具有比胶原更强的力学性能，是比较理想的软骨组织工程支架材料，但羟基磷灰石在体内降解缓慢，诱导成骨以重建软骨下骨的性能也不够理想是主要缺陷。 4.同种异体软骨细胞移植修复关节软骨缺损不引起严重的免疫排斥反应。 5.软骨细胞+Ⅰ型胶原/羟基磷灰石分层支架复合体植入兔膝关节软骨缺损可以获得类透明软骨修复，但远期效果有待长期观察。 6.rhBMP7基因转染软骨细胞+支架复合体植入组在早期比软骨细胞+支架复合体植入组修复效果好，但远期效果两者差异不大，可能由于BMP7基因随着细胞的分裂、传代而逐渐丢失不能长期表达，或植入的细胞在体内逐渐凋亡所致。