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背景:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方常见的头颈部恶性肿瘤,早期NPC患者对放射治疗敏感,但晚期NPC患者放射治疗疗效欠佳,易出现复发和转移。因此,寻找新的治疗肿瘤的方法迫在眉睫。新的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,在肿瘤的治疗中显示了极具前景的应用价值。它通过一些小的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)阻断特定基因的表达,诱导mRNA的降解,达到“基因沉默”(gene silencing)、抑制细胞增殖和侵袭的功效,从而抑制肿瘤的生长和转移。有研究证实,人类乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)与头颈部恶性肿瘤有密切关系,主要为高危的HPV16、18型,其中HPV16的E6蛋白表达水平是维持癌症恶性表型的必要条件。已有研究显示,利用RNAi技术干扰HPV16E6基因能抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导凋亡,但有关RNAi技术干扰HPV16E6基因对鼻咽癌细胞株的影响报道甚少。本研究旨在探讨利用RNAi技术干扰HPV16E6基因对鼻咽癌HNE-1细胞株的影响。目的:本研究以人鼻咽癌HNE-1细胞株为研究对象,用针对HPV16E6的小片段干扰RNA(small interfering RNAs,siRNA)转染细胞,干扰鼻咽癌细胞株中HPV16E6基因转录及蛋白表达,并探讨siRNA对HNE-1细胞增殖、凋亡及侵袭力的影响作用。方法1.转染细胞:查找HPV16E6基因序列,设计针对E6基因的4对siRNA。将siRNA转染入HNE-1细胞,并在荧光显微镜下检测转染效率。2.筛选有效的siRNA。实验分为5组:4对siRNA组及阴性对照组。采用RT-PCR技术检测转染后HPV16E6 mRNA的表达,Western blot及免疫细胞化学法检测转染后HPV16E6蛋白表达情况,筛选出对HPV16E6干扰有效的siRNA。以有效的siRNA进行下一步实验,同时设立细胞空白组(未转染组)及阴性对照组(siRNA-5转染组)。3.采用MTT法观察各实验组细胞的增殖情况。4.采用流式细胞仪检测各实验组的细胞周期。5.流式细胞仪检测各实验组细胞的凋亡。6.侵袭实验检测各实验组细胞的侵袭力变化。结果1.将转染后24h的细胞在荧光显微镜下观察,可见绿色荧光,说明转染成功,计算转染率为60%。2.转染后48h,RT-PCR检测结果显示,siRNA-3转染组对HPV16E6 mRNA的抑制率为66.3%,与其余4组相比,差异有显著意义(P<0.05);Western blot检测发现siRNA-3明显抑制HPV16E6蛋白表达,抑制率为56.7%,有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学结果显示,阴性对照组中HPV16E6阳性表达细胞数为65.2%,而siRNA-3转染组中HPV16E6阳性表达细胞数为20.1%,提示HPV16E6蛋白表达被抑制。3.MTT结果显示,在转染24h、48h、72h后,细胞增殖抑制率分别为24%、23%、30%,较阴性对照组明显降低,差异有显著意义(P<0.05)。4.流式细胞仪检测细胞周期,结果显示转染了siRNA-3后G0-G1期比率为80.46%,而阴性对照组其比率为65.55%,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.流式细胞仪检测发现,转染siRNA-3后HNE-1细胞凋亡率约为16.82%,与阴性对照组相比,有统计学意义(P<0.05)。6.侵袭实验发现,实验组穿膜细胞数(45.3±4.0)明显少于细胞空白组穿膜细胞数(146.7±5.5)及阴性对照组穿膜细胞数(147.7±4.7),差异有显著的统计学意义(P<0.05)。结论1.针对HPV16E6的siRNA可以有效地抑制鼻咽癌HNE-1细胞株中HPV16E6 mRNA及蛋白的表达。2.siRNA干扰HPV16E6基因能显著地降低人鼻咽癌HNE-1细胞株的增殖能力。3.siRNA干扰HPV16E6基因能使人鼻咽癌HNE-1细胞株的DNA合成下降(S期细胞分布比例降低),细胞生长停滞于G0-G1期。4.siRNA干扰HPV16E6基因能诱导人鼻咽癌HNE-1细胞株的凋亡。5.siRNA干扰HPV16E6基因能降低人鼻咽癌HNE-1细胞株的侵袭能力。