弓形虫是一种机会性胞内寄生虫,它能够感染几乎所有的温血动物包括野生哺乳动物、鸟类、家畜和人类。由弓形虫感染而引起的弓形虫病遍布全球各个角落,弓形虫病是人兽共患病,严重威胁畜牧业的发展和人类健康。目前尚无针对弓形虫病的特效药物,因此对弓形虫病的防治工作迫在眉睫。本实验利用相应软件和在线数据库分析了弓形虫表面抗原蛋白5 (Surface Antigen Glycoprotein 5, SAG5)的理化特点、同源性、二维结构、三维结构、B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。构建SAG5A和SAG5D的DNA重组疫苗来免疫小鼠,并利用抗原多肽和α半乳糖神经酰胺(a-GalCer)增强疫苗的免疫反应,通过动物实验验证疫苗的可靠性。本研究工作填补了弓形虫表面抗原蛋白SAG5的认知空白,为弓形虫病有效疫苗的研制提供了参考。目的：研究弓形虫表面抗原蛋白SAG5的基本理化性质、二维结构和三维空间结构。分析弓形虫表面抗原蛋白SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。构建SAG5A基因的重组DNA载体并与多肽(HAPTPSFLGLLAVVF)一同免疫小鼠,通过对小鼠脑部包囊计数来评价SAG5A基因与多肽的免疫保护性。构建SAG5D基因表达载体并与a-GalCer-同免疫小鼠,通过弓形虫速殖子和包囊攻击实验来评价SAG5D基因和a-GalCer一起对小鼠的免疫保护性。方法：利用在线分析软件预测SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的理化性质、跨膜区域和信号肽序列。运用在线程序PSORTⅡ分析SAG5A、 SAG5B、SAG5C和SAG5D的亚细胞定位。利用在线程序NetNGlyc1.0分析SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的N-糖基化位点。运用在线程序CSS-Palm和NetPhos 2.0分析SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的磷酸化位点和酰基化位点。利用DNASTAR、Gene Runner和DNAMAN等软件预测SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的B细胞抗原表位。利用在线分析软件IEDB预测SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的T细胞抗原表位。利用在线工具T-Coffee对这四种蛋白的序列进行比对,运用在线分析软件SWISS-MODEL和软件VMD预测SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的二维和三维结构。利用引物设计软件设计出SAG5A和SAG5D的上下游引物,PCR反应得到SAG5A和SAG5D的目的基因,经过双酶切将目的基因和pEGFP-C1载体连接在一起构建SAG5A和SAG5D的真核表达载体。构建好的载体通过测序来检验SAG5A和SAG5D基因的完整性。利用试剂盒大量提取构建的SAG5A和SAG5D真核表达质粒来免疫BALB/c小鼠。在SAG5D基因疫苗免疫小鼠过程中通过加入佐剂α半乳糖神经酰胺(a-GalCer)来提高免疫效应。构建的SAG5A基因疫苗引入抗原多肽并通过免疫策略来提高免疫效果。在基因疫苗免疫后对小鼠取血并收集血清,通过检测小鼠血清中抗弓形虫总IgG、IgG1、 IgG2a及脾细胞内细胞因子IL-4、IL-10、IFN-y的含量来评价疫苗刺激产生的免疫反应。对SAG5D和a-GalCer免疫的小鼠通过弓形虫速殖子(RH株)和包囊(PRU株)攻击实验来验证疫苗的保护性。对SAG5A和抗原多肽免疫的动物用包囊(PRU株)攻击来验证免疫策略的作用及基因疫苗的保护性。结果：利用软件和在线工具分析了SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D四种蛋白的理化性质,结果显示SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D拥有相似的物理化学参数,其中SAG5A和SAG5D有相近的理化参数,SAG5B和SAG5C有着更为相近的理化性质。运用在线程序PSORTⅡ分析这四种蛋白的亚细胞定位,结果显示SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D均分布在质膜上的概率最大。对这些蛋白翻译后修饰的预测发现它们有相似的糖基化位点、磷酸化位点和酰基化位点,其中SAG5B和SAG5C的修饰位点基本一致。利用DNASTAR软件和IEDB数据库分析了SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D蛋白的B细胞抗原表位,结果显示SAG5B和SAG5C具有相近的B细胞抗原表位,利用在线IEDB数据库分析它们的T细胞抗原表位,并筛选出一些优秀的亲水性强、可塑性大和抗原指数高的抗原表位区域,结果表明这四种蛋白均是良好的表位抗原,此外我们还用这些软件和数据库分析了SAG1蛋白的B细胞和T细胞表位抗原,并将这四种蛋白的表位抗原与SAG1比较,结果显示SAG5A和SAG5D有更优秀的抗原表位,SAG5B和SAG5C的抗原表位与SAG1相近。经过T-Coffee软件的序列比对,SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D具有很高的同源性,而SAG5B和SAG5C的相似度更是达到了96%。通过DNASTAR和VMD软件分析,SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D蛋白具有相近的β折叠和α螺旋区域,而SAG5B和SAG5C有着几乎一样的β折叠和α螺旋分布。经过VMD软件分析,这些蛋白有着相似的三维空间结构,而SAG5B和SAG5C的空间结构几乎完全一样。利用引物设计软件成功设计出SAG5A和SAG5D的上下游引物,以弓形虫cDNA为模板,利用PCR反应得到产物,经过凝胶电泳分析得到大小均为1,089 bp的SAG5A和SAG5D基因片段,利用胶回收试剂盒回收并纯化大量目的基因SAG5A和SAG5D。将目的基因和pEGFP-C1真核表达载体双酶切,在DNA连接酶的帮助下,将目的基因和载体连接在一起。重组后载体转染DH5α感受态细胞,菌液涂板后每个培养皿中得到5-10个独立菌株,将菌株挑到液体培养基中培养,利用质粒提取试剂盒将菌体中质粒提取出来,双酶切和琼脂糖凝胶电泳实验显示在4,700bp和1,089bp处有明亮条带,这证明我们成功构建了pEGFP-C1-SAG5A (pSAG5A)和pEGFP-C1-SAG5D (pSAG5D)的真核表达载体。将菌体大量培养,利用无内毒素大提试剂盒大量提取无内毒素质粒,检测提取质粒的浓度均在1,000 μg/ml以上,达到后续试验要求。为验证构建载体在细胞内正常表达,将无内毒素载体转染至HEK 293-T细胞,利用荧光显微镜观察pSAG5A和pSAG5D转染的细胞,两组细胞均能被激发出绿色荧光,这说明重组载体可在细胞中正常表达蛋白。将转染的细胞大量收集并裂解提取细胞全蛋白,并对提取的蛋白进行Western blot实验检测,结果在60 kD处有特异性条带出现,进一步证明了重组载体中SAG5A和SAG5D基因能够成功表达成蛋白。pSAG5A载体和筛选的多肽依据制定的策略先后免疫BALB/c小鼠,pSAG5D真核表达载体和a-GalCer一同免疫小鼠,每次免疫2周后对对照组(PBS和pEGFP-C1组)和免疫组(a-GalCer、pSAG5、pSAG5、pSAG5D/a-GalCer和pSAG5A/多肽组)小鼠进行取血,吸取血清并检测其中抗弓形虫总IgG、IgG1、IgG2a抗体的浓度。pSAG5A和多肽免疫的小鼠血清中IgG和IgG2a抗体的水平显著高于对照组和其它实验组(P<0.05); pSAG5A免疫组和多肽免疫组中IgG和IgG2a抗体的水平明显高于空白对照组(P<0.05),pSAG5A免疫组和多肽免疫组之间没有显著性差别(P>0.05)；实验组和对照组小鼠的IgG1抗体浓度没有显著性差异(P>0.05)。pSAG5D和α-GalCer-同免疫的小鼠血清中IgG和IgG2a抗体的水平明显高于其它组(P<0.05)；pSAG5D免疫组和α-GalCer免疫组中IgG和IgG2a抗体的水平显著高于空白对照组(P<0.05),而pSAG5D免疫组和α-GalCer免疫组之间没有显著性差别(P>0.05)；各组小鼠的IgG1抗体浓度没有显著性差异(P>0.05)。为进一步证明小鼠的免疫反应,小鼠脾细胞中细胞因子IL-、IL-10、IFN-γ的水平被检测。pSAG5A和多肽共同免疫组中IFN-γ的水平(721.0±99.6)显著高于其它实验组和对照组(P<0.05)；pSAG5A(505.3±71.6)和多肽(489.7+98.9)两个实验组中的IFN-y水平显著高于空载体组(52.4+11.6)和PBS组(55.5±11.7)(P<0.05),但两者之间没有显著性差异(P>0.05)；而细胞因子IL-4和IL-10的水平在各组间没有显著性差别(P>0.05)。pSAG5D和α-GalCer一起免疫小鼠脾细胞的IFN-y水平(781.36±57.57)显著高于其它组(P<0.05);pSAG5D组(573.43±60.2)和α-GalCer组(343.6±50.88)中的IFN-γ水平明显高于pEGFP-C1组(53.15±8.71)和PBS组(52.07+8.23)(P<0.05); pSAG5D和α-GalCer共同免疫组(76.73±6.08)及α-GalCer免疫组(75.46±5.7)中小鼠脾细胞中IL-4的水平显著高于pSAG5D组(36.65±3.52)、pEGFP-C1组(39.24±6.43)和PBS组(36.36±5.25)(P<0.05)；而所有小鼠的IL-10的水平没有显著性差异(P>0.05)。最后通过弓形虫攻击实验来评价基因疫苗的免疫保护性。用弱毒株(PRU)弓形虫包囊攻击SAG5A所有组的小鼠,结果显示pSAG5A和多肽共同免疫小鼠脑内的包囊数量(436±174)明显少于其它组(P<0.05)；pSAG5A组(815±197)和多肽组(732±160)小鼠脑内包囊显著性少于pEGFP-C1组(1350±268)和PBS组(1260±241)(P<0.05),而pSAG5A组和多肽组之间没有显著性差别。另一实验中,用强毒株(RH)弓形虫速殖子和弱毒株(PRU)包囊攻击SAG5D所有组的小鼠,结果显示pSAG5D和α-GalCer一起免疫小鼠的生存期能达到17天,而pSAG5D组、α-Ga1Cer、 pEGFP-C1和PBS组的生存时间分别为13天、10天、7天和6天。同时pSAG5D和α-GalCer免疫小鼠脑内包囊数量最少(P<0.05)。结论：生物信息学分析表明SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的同源性很高,这四种蛋白都具有优秀的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位,且SAG5A和SAG5D蛋白的抗原性更加突出。真核表达载体pSAG5A和pSAG5D均能在真核细胞中和小鼠体内成功表达；SAG5A和SAG5D基因疫苗均能诱导小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫；a-GalCer确实能够增强弓形虫SAG5D基因疫苗的免疫效应；抗原多肽与SAG5A基因疫苗的策略使用能够诱导更强烈的免疫效应；在动物实验中这两种DNA疫苗均能为小鼠提供抵抗弓形虫感染的免疫能力。