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甘草是我国最常用的大宗药材之一,其主要基原植物为甘草Glycyrrhiza uralensis。目前,甘草药材主要来源于人工栽培,但栽培甘草的活性成分含量普遍偏低,质量不稳定,达不到药典标准,制约了甘草资源的可持续发展。脱落酸（abscisic acid,ABA）与甘草活性成分的积累密切相关,外源ABA可使甘草的活性成分含量明显增高。ABA在植物生长过程中起到重要的作用,能够通过内源合成、信号转导以及与其他激素的互作等多方面调控次生代谢物质的合成。碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper,bZIP）转录因子能够通过参与ABA信号转导通路来调控次生代谢产物的合成。甘草活性成分生物合成的调控机制研究尚十分匮乏,在甘草中调控活性成分合成的bZIP转录因子也尚未报道。本研究利用Illumina高通量测序技术对不同浓度ABA处理的甘草转录组进行测序,并基于已发表的甘草全基因组数据,鉴定了甘草中的bZIP转录因子并对其理化性质和结构进行分析;之后筛选响应ABA胁迫后上调的bZIP转录因子基因作为本研究的候选基因,构建候选基因过表达和RNAi载体并转入甘草外植体,获得毛状根;最后检测毛状根中候选GubZIPs基因及甘草活性成分生物合成途径关键酶基因的表达,并检测毛状根及其培养液活性成分含量,对候选基因的功能进行验证。本研究主要结果如下:1.甘草bZIP转录因子的鉴定及响应ABA胁迫的甘草bZIP转录因子筛选基于已发表的甘草全基因组数据,本研究共鉴定到69个甘草bZIP转录因子,命名为GubZIP1～69,并根据它们与拟南芥bZIP的同源相似性分为A～I以及S这10个亚家族。通过测定GubZIPs基因在不同浓度外源ABA胁迫下的转录组数据以及Real-time PCR验证,最终确定GubZIP1、GubZIP5、GubZIP30、GubZIP33和GubZIP56基因是响应ABA胁迫后上调的甘草bZIP转录因子,作为本研究的候选转录因子。2.候选基因的克隆及结构分析对候选基因进行克隆,GubZIP1、GubZIP5、GubZIP33和GubZIP56克隆成功,测序结果与基因组和转录组数据一致。候选蛋白的二级结构以α螺旋为主,伴有β折叠、转角、无规则卷曲结构。蛋白三级结构预测结果显示GubZIP1,GubZIP5,GubZIP33蛋白为二聚体结构,GubZIP56蛋白为单体结构。候选基因编码蛋白均无跨膜结构域,属于非分泌蛋白,且都定位于细胞核。顺式作用元件预测结果显示,候选转录因子基因GubZIPs启动子区均含有ABA响应元件ABRE。3.候选GubZIPs基因过表达/RNAi重组质粒构建及甘草遗传转化本研究建立了候选GubZIPs基因过表达/RNAi重组质粒构建及甘草遗传转化方案,即:以pK7WG2D和pK7GWIWG2D（Ⅱ）分别为过表达和RNAi载体,采用Gateway（?） Technology进行重组质粒构建,冻融法转化农杆菌ACCC10060;以甘草子叶（切为两半）为外植体,用含有重组质粒的发根农杆菌（OD600=0.5）浸染30 min,于6,7-V+AS（200 mg/L）固体培养基上25℃黑暗中共培养48-72 h。共培养结束后,用Cef溶液（400 mg/L）除菌后移入6,7-V+Kan（50 mg/L）+Cef（500 mg/L）固体培养基上进行筛选培养。待抗性毛状根长至3.0 cm左右后将其切下,转入 6,7-V+Kan（50 mg/L）+Cef（500 mg/L）+IAA（0.1 mg/L）固体培养基上并标号,刺激毛状根长出侧根,培养一周左右后,将阳性根转入含6,7-V+Kan（50 mg/L）+Cef（500 mg/L）培养基上恢复培养,以此方法培养出的毛状根阳性率可达37.8%。待生长出大量侧根后转移至液体6,7-V培养基于120 rpm,25℃黑暗中摇床培养。4.甘草毛状根基因表达及活性成分测定检测阳性转基因毛状根中GubZIPs基因过表达和抑制表达的效率,结果显示GubZIP5、GubZIP33和GubZIP56均有较高的过表达效率和抑制表达效率。RNAi/过表达GubZIPs基因对毛状根中黄酮和三萜类活性成分生物合成途径关键酶基因表达的影响分析结果显示,GubZIP5、GubZIP33和GubZIP56的过表达及抑制表达均可影响CHI、CHS、HMGR、SQS、UGT和β-AS基因的表达,且成正相关。检测转基因毛状根及其培养液中黄酮和三萜类活性成分含量,结果显示毛状根中的总黄酮、总三萜、甘草苷（GubZIP56的RNAi株系除外）、甘草素（GubZIP5和GubZIP56的RNAi株系除外）和异甘草素的含量变化的总体趋势均呈现为随着候选GubZIPs的过表达而上升,GubZIPs的表达被抑制而减少。异甘草苷、甘草查尔酮A、甘草酸和甘草次酸在个别转基因毛状根中检测到。毛状根培养液中的总黄酮、总三萜和甘草素含量变化的总体趋势与毛状根的相同;甘草苷的含量也随着候选GubZIPs的过表达而上升,但没有随着GubZIPs的表达被抑制而减少;异甘草素的含量无论是在过表达组还是在RNAi组变化均不显著。本研究首次对甘草响应ABA胁迫的bZIP转录因子进行了筛选鉴定,并通过构建甘草毛状根转化培养体系,对候选bZIP转录因子调控甘草活性成分生物合成的功能进行验证。本研究为ABA介导的bZIP转录因子调控甘草次生代谢产物合成的分子机研究制奠定基础,进而为选育优质甘草种质资源、提高甘草药材品质提供理论依据。