微孢子虫(Protozoan:Microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核微生物,其种类繁多,寄主广泛,目前已发现的微孢子虫有近150属超过1200个种。自1959年首次发现微孢子虫可以感染免疫缺陷型病人以来,相继发现8个属14个种的微孢子虫可以感染人类,引起了医学和科学上的广泛关注。微孢子虫具有独特的侵染方式,且进化地位极其特殊,同时还是具有良好前景的潜在生防制剂,因此近年来关于微孢子虫的研究越来越广泛和深入。家蚕微孢子虫是Nosema属的典型种,可通过胚胎向下代垂直传播,引发家蚕微粒子病导致毁灭性病害。但目前国内外家蚕微孢子虫分子生物学基础研究还处于起步阶段,技术手段相对薄弱,基础数据积累严重不足。本研究基于实验室已有试验结果,在孢子母细胞的分离纯化、家蚕微孢子虫蛋白质组学研究平台的构建、昆虫体外培养细胞对家蚕微孢子虫吞噬作用的机制,及位于孢子壁结构上的孢壁蛋白在感染寄生宿主的过程中可能扮演的角色作了深入地探讨。主要研究结果如下：1、本研究初步建立了从重度感染Nb的家蚕中肠中分离空孢子、早期孢子母细胞、晚期孢子母细胞和成熟孢子的方法。利用Percoll-蔗糖密度梯度离心法,通过两次超速离心获得高纯度的孢子生殖期的孢子,为对家蚕微孢子虫进一步的生物生化研究和分子生物学研究提供了良好材料。2、构建了家蚕微孢子虫蛋白质组学研究技术,并使用该技术初步分析了成熟孢子和晚期孢子母细胞的蛋白表达差异。以玻璃珠破碎法为基础的蛋白提取方法可有效避免蛋白被降解或污染,获得的孢子总蛋白质量较高,可直接用于双向电泳；使用非线性大凝胶可将蛋白很好地分离,获得高分辨率的蛋白图谱。从成熟孢子蛋白凝胶中挖取100个高丰度蛋白点(包括与晚期孢子母细胞的差异蛋白)进行MALDI-TOF/TOF MS分析,其中87个蛋白点获得良好质谱图谱,搜索数据库,获得15条可信蛋白结果,其中成熟孢子中高丰度表达而晚期孢子母细胞中未表达的蛋白点1为NbSWP5。3、运用在线软件分析NbSWP5序列,发现其等电点约为4.54,分子量约为20300Da,N末端有一段长度为22个氨基酸的信号肽,有7个“O位”糖基化位点。在GenBank数据库中,使用BLASTP程序比对序列,未发现其它同源性蛋白,表明NbSWP5为家蚕微孢子虫特有蛋白。进一步利用大肠杆菌表达系统大量表达NbSWP5蛋白,并以纯化的NbSWP5蛋白为抗原制备anti NbSWP5兔多抗。免疫电镜结果显示NbSWP5蛋白大量分布于成熟孢子外壁。4、深入研究了昆虫体外培养细胞对家蚕微孢子虫吞噬作用的机制。鳞翅目昆虫培养细胞BmN、Sf9和Tn均可吞噬孢子壁受损的冷冻孢子、氢氧化钾长时间处理的孢子及孢子壁未发育完全的晚期孢子母细胞,被吞噬的孢子既没有被消化也没有进一步感染细胞。而孢子壁完整的新鲜孢子则对这种吞噬作用有一定的抵抗力。由此推测,孢子壁不完整的孢子,其病原相关分子模式裸露,被宿主细胞的识别受体识别,引发基于细胞肌动蛋白聚合作用的吞噬作用。5、利用重组NbSWP5蛋白包被孢子壁不完整的冷冻孢子、氢氧化钾长时间处理的孢子及晚期孢子母细胞,可以显著降低孢子的吞噬率。证明NbSWP5起到屏蔽病原分子相关模式,使孢子免于被宿主细胞识别,避免类似抗原呈递过程的发生。由于NbSWP5蛋白与RodAp等已鉴定的保护性蛋白没有同源性,其功能还有待进一步验证。