CTSD和CTSH基因分别编码溶酶体中典型的天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶.作为溶酶体中活性最高的两种酶,在蛋白水平已经被证实存在猪品种间遗传差异,在猪肉的嫩度、风味以及加工品质中具有重要作用.2005年本课题组已经克隆获得猪CTSD基因全长cDNA序列.猪CTSH基因也被定位在猪7号染色体上(7q12-q23或7q26),在该区域已经发现多个影响背膘厚、IMF和眼肌面积的QTLs.然而至今在猪中这两个基因的基因组序列及其结构特点,以及在中外猪种中的差异仍不清楚.因此本研究为进一步明确这两个基因与猪胴体与肉质等重要经济性状的关系,从获取基因序列入手,分析其序列变异、时空表达等特征.并通过本研究所建立的猪胎儿成纤维细胞系细胞转染实验,筛选有效干扰CTSD基因表达的siRNA序列,为在体外细胞水平研究其功能奠定基础。主要研究结果如下: 1、利用比较基因组学和PCR方法,对猪CTSD和CTSH基因结构进行分析发现:猪CTSD基因全长9,064 bp,具有天冬氨酸蛋白酶家族基因9个外显子的保守结构;CTSH基因推测其具有半胱氨酸蛋白酶家族基因12个外显子的基因结构,并获得CTSH基因外显子3-12之间共16,515 bp DNA序列. 2、采用不同品种PCR产物混合测序方法,对猪CTSD和CTSH基因进行SNP筛查发现:在CTSD基因共发现35个SNP位点,其中11个位于外显子,24个位于内含子,变异主要集中在内含子4和内含子5;在CTSH基因共发现50个SNP位点,6个位于外显子,44个位于内含子. 3、采用PCR-RFLP方法对两个基因在中外猪种(大花白、蓝塘、长白和杜洛克)群体中的基因型频率差异进行分析发现:CTSD基因3个SNP位点在大花白、蓝塘、长白和杜洛克这4个中外猪种间,其基因型频率差异极显著.其中CTSD外显子9上8715A>G位点碱基突变导致NEUROD1转录因子结合位点发生变化,在发生突变时转录因子结合能力改变;对CTSH基因的9个SNP位点,其基因型频率在中外猪种间差异极显著.因此CTSD和CTSH基因的12个PCR-RFLP位点具有作为分子标记的潜力. 4、利用生物信息学结合RACE技术,克隆获得了CTSH基因全长cDNA序列,并鉴定了四种剪切体(H-V1、H-V2、H-V3和H-V4).分析发现:猪CTSH基因剪切热点在外显子6、7、8,剪切形式都是外显子跳跃;H-V1和H-V2编码蛋白具有完整的信号肽、前肽区和成熟肽结构,而H-V3和H-V4则只有部分成熟肽结构,这提示H-V3和H-V4编码蛋白质合成后,将不能沿内质网途径进入溶酶体,而弥散于胞浆中发挥水解作用. 5、利用多组织RT-PCR对CTSH基因四种选择性剪切体的组织表达谱进行分析发现:四种剪切体在小脑、肺、大脑、肾、背最长肌、脾、肝、小肠、胃、下丘脑、腹脂、大肠、心、胰和膀胱等15个组织中广泛表达，只有H-V2在大脑、小脑和腹脂组织中表达丰度很低.表明猪CTSH基因四种剪切体除H-V2外，其余三种剪切体均无明显组织表达特异性. 6、采用实时定量PCR对C7SD和CTSH基因在长白和蓝塘猪骨骼肌发育5个时期(出生、27日龄、90日龄、150日龄和180日龄)的时空表达进行分析发现:CTSD基因在蓝塘猪骨髂肌中表达规律呈现缓慢上升后再缓慢下调的趋势;而在长白猪骨骼肌中表达规律是先急剧下降然后在90日龄时表达量最高时接着缓慢下调至出生时的水平;CTSH基因剪切体H-V1、H-V3和H-V4表达模式相似，在蓝塘猪从出生到150日龄前的骨骼肌组织中的表达量远高于长白猪，而在到达180日龄后三种剪切型的表达量在长白猪中才超过蓝塘.但是H-V2在从出生到150日龄阶段在长白猪中表达量均高于蓝塘猪，只有到达180日龄后在蓝塘猪中表达量才高出长白猪，这种与骨骼肌和脂肪发育规律完全不同的结果提示H-V2可能在猪肌肉生长发育过程中与其他3种剪切型有不同的功能. 7、采用建立猪胎儿成纤维细胞系、体外细胞转染、体外生物合成shRNA的方法，获得了一条对CTSD基因抑制效率达64.7％的siRNA，为后续进一步进行该基因的功能研究奠定了基础。 本研究结果显示CTSD和CTSH基因存在丰富的遗传变异，在不同群体中遗传差异显著，而且从表达水平也证实两个基因存在中外猪种间时空表达差异，其SNPs位点有可能作为猪胴体与肉质等经济性状的分子标记.并克隆了CTSH基因全长cDNA及四种选择性剪切体，发现它们分别编码不同的氨基酸序列，提示CTSH基因在不同细胞和不同时期通过选择性剪切的方式发挥不同功能.同时获得的CTSD基因siRNA干扰序列为后续反向遗传学研究该基因的功能提供了必要的条件.