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目的:锰（Manganese,Mn）广泛分布于生物圈,在人体内含量甚微但却是必需微量元素,在体内众多代谢过程中扮演重要角色。长时间暴露于锰环境中,锰可通过血脑屏障进入脑内,沉积在黑质及纹状体中,造成广泛的病理性损伤,产生相应的神经系统受损症状,称之为锰中毒。目前研究主要集中于以下几种机制:多巴胺耗竭、线粒体功能障碍、神经递质释放异常和氧化应激,但其具体机制还不明确。有研究表明,锰暴露会干扰脑内神经元的神经递质信号传递,而干扰氨基酸类神经递质释放是锰致神经退行性疾病的一个重要的细胞分子学机制。可溶性N-甲基马来酰胺敏感因子附属蛋白受体（Soluble N-ethylmaleimide-sensitive accessory protein receptor,SNARE）是突触囊泡融合过程中的核心成分,而且参与几乎所有分泌细胞的胞吐过程,由Syntaxin-1,VAMP-2和SNAP-25三种蛋白组成。其中SNAP-25能与Synaptotagmin作用,在突触囊泡停泊中发挥重要作用;Syntaxin-1与Munc 18蛋白结合可抑制其正常生理功能,干扰SNARE复合物的形成;VAMP-2可与Synaptophysin结合形成新的复合物,作为VAMP-2储备池,使突触囊泡能应对突然增加的神经递质释放的需求。α-突触核蛋白（Alpha-Synuclein,α-Syn）主要位于中枢神经系统神经突触前膜末梢和细胞核膜上,在生理状态下其单体对神经元有保护作用,可以参与突触传递、调节突触囊泡的密度、提高神经元细胞的可塑性以及维护突触的正常功能。有研究表明α-Syn可以结合VAMP-2,促使SNARE复合物的形成,从而促进囊泡与突触前膜融合。有研究认为α-Syn的寡聚中间体可能是由α-Syn介导的细胞死亡过程中的一个重要进程。大量研究表明α-Syn与突触囊泡形成及融合关系密切,于是我们推测在α-Syn过表达的神经元中,α-Syn易聚集,导致突触囊泡功能失调,最终发展为神经退行性疾病。钙蛋白酶（Calpain）可以裂解多种细胞溶质内、细胞膜上或细胞骨架上的蛋白质,可改变多种内源性蛋白质的完整性、位置和活性,从而激活或抑制其基本生理功能。最近有研究表明,SNAP-25是Calpain的裂解底物之一。本研究分别以原代培养神经元、成年昆明小鼠、SH-SY5Y细胞系为研究对象,建立神经元的锰暴露模型,研究锰对突触囊泡融合的影响;建立SH-SY5Y细胞系的锰染毒模型,研究锰致SNARE复合物形成障碍机制;建立锰短期重复暴露动物模型,研究锰致Glu和GABA释放障碍机制。以锰影响SNARE复合物的形成为出发点,用钙蛋白酶抑制剂抑制Calpain活性,再利用shRNA干扰技术,抑制α-Syn基因和蛋白的表达,进一步探讨锰干扰突触囊泡融合的具体机制,为锰致神经毒性机制的研究提供实验依据。研究方法:1、体外培养新生鼠神经元,经神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific enolase,NSE）免疫荧光鉴定阳性率90%以上可进行后续实验。先将神经元分为5个剂量组,染毒终浓度分别为0、25、50、100、200μM,每个剂量组都分别在0、6、12、24h时检测噻唑蓝（Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）及乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）,用以检测神经元活力。根据上述实验结果,选择100μM这一染毒终浓度,分别暴露0、6、12、18、24h,进行后续指标检测。分别用PCR和Western blotting方法测定Syntaxin-1,VAMP-2,SNAP-25,Synaptophysin,Synaptotagmin 1和Munc 18的mRNA及蛋白表达;免疫荧光和免疫共沉淀方法检测Syntaxin-1和Munc 18及Synaptophysin与VAMP-2之间的相互作用;用非变性Western blotting方法检测SNARE复合物形成水平;FM1-43荧光染色检测活动性突触囊泡的融合。2、将SH-SY5Y细胞分为六个剂量组,分别为对照组,200μM锰处理组,shRNA转染组,shRNA转染+200μM锰处理组,错译shRNA转染组,错译shRNA转染+200μM锰处理组。用倒置荧光和分子学实验方法鉴定慢病毒转染效率;检测细胞活力及培养液中LDH的释放量;测定Syntaxin-1,VAMP-2,SNAP-25和Synaptophysin的mRNA及蛋白表达;检测α-Syn与VAMP-2及Synaptophysin与VAMP-2之间的相互作用;检测SNARE复合物的形成以及活动性突触囊泡的融合。3、用成年SPF级昆明小鼠48只,按体重随机分为8组,分别为生理盐水对照组,25、50、100μmol/kg氯化锰染毒组,100μg/kg钙蛋白酶抑制剂——Calpeptin对照组,Calpeptin预处理组:分别用25、50、100μg/kg Calpeptin预处理2h后,再注射100μmol/kg氯化锰。每组6只,雌雄各半。连续染毒24天,分别在第8、16、24天进行旷场实验,24天旷场实验结束后取大脑基底核进行指标检测。用微波消解-原子吸收法检测脑内锰含量;测定细胞内Ca2+浓度及Calpain活性;通过透射电镜进行基底核突触体观察;用高效液相色谱（High performance liquid chromatography,HPLC）法检测大脑基底核神经突触间隙内源性谷氨酸（Glutamate,Glu）和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）浓度;测定Syntaxin-1,VAMP-2和SNAP-25的mRNA及蛋白表达;检测SNARE复合物形成水平和活动性突触囊泡的融合。结果:1、随着染锰剂量的增加（0-200μM）及时间的延长（0-24h）,神经元的活力不断下降,呈剂量-时间依赖效应关系。在染锰剂量为100μM时最有利于后续实验的毒性判断,故选择此剂量进行不同时点染毒。各组神经元Synaxtin-1蛋白表达未发生明显改变,SNAP-25蛋白表达呈时间依赖性下降,VAMP-2和Munc 18蛋白呈时间依赖性升高。Syntaxin-1和Munc 18之间的蛋白相互作用在18h和24h时明显升高,VAMP-2和Synaptophysin之间的蛋白相互作用可见二者结合在12h时明显升高;但在24h显著下降。100kDa的SNARE复合物形成一直处于下降趋势,而80kDa的SNARE复合物在染锰12h时出现升高现象,但在染锰24h下降。突触囊泡融合水平与80kDa的SNARE复合物形成结果趋势一致。2、慢病毒干扰α-Syn表达模型,转染效率达到90%以上,可以有效的降低α-Syn mRNA和蛋白的表达。锰处理细胞24h后,LDH释放量,细胞凋亡率,α-Syn及VAMP-2的mRNA和蛋白表达均升高,并且α-Syn与VAMP-2之间的相互作用增强,Synaptophysin与VAMP-2之间的相互作用减弱,使VAMP-2不能行使正常的生理功能,SNARE复合物的形成及FM1-43标记的突触囊泡释放减少。用100μM锰分别处理α-Syn表达下调细胞和正常细胞对比发现,α-Syn表达下调细胞损伤程度明显下降,Synaptophysin与VAMP-2之间的相互作用明显恢复,并且α-Syn与VAMP-2之间的相互作用也减弱,SNARE复合物的形成及FM1-43标记的突触囊泡释放增多。携带错译shRNA慢病毒转染的细胞对各项指标没有影响。3、与对照组相比,100μmol/kg染锰组小鼠连续染毒24天后,旷场实验显示其平均速度和在中心区域停留时间与对照组相比都明显下降,且随着染锰剂量的升高,小鼠基底核内锰含量明显升高,电镜结果显示100μmol/kg染锰组小鼠突触囊泡数量下降,突触前后膜融合,突触后致密物增厚,这些结果提示了小鼠亚急性锰暴露模型建立成功。50、100μmol/kg染锰组小鼠细胞内钙离子浓度和钙蛋白酶活性均明显升高;各染毒组小鼠Syntaxin-1蛋白表达未发生明显改变,SNAP-25蛋白表达发生不同程度下降,在50、100μmol/kg染锰组小鼠出现SNAP-25-N端裂解碎片,VAMP-2蛋白表达出现不同程度的升高;SNARE复合物80kDa蛋白复合物在25、50μmol/kg染锰组明显升高,在100μmol/kg染锰组下降,100kDa蛋白复合物没有明显变化;FM1-43染色显示50μmol/kg染锰组小鼠活动性囊泡明显升高,100μmol/kg染锰组小鼠明显下降。用Calpeptin干预后,与100μmol/kg染锰组小鼠比较,基底核内锰浓度和钙离子浓度均未发生改变;随着钙蛋白酶抑制剂浓度升高,各干预组小鼠Syntaxin-1蛋白表达未发生明显改变,SNAP-25蛋白表达发生不同程度升高,100μg/kg Calpeptin干预组小鼠未检出SNAP-25-N端裂解碎片,VAMP-2蛋白表达未出现明显改变;SNARE复合物100kDa蛋白复合物在50、100μg/kg Calpeptin干预组明显升高,80kDa蛋白复合物没有明显变化;FM1-43染色显示100μg/kg Calpeptin干预组活动性囊泡明显增多。结论:锰可通过干扰SNARE复合物相关蛋白表达导致SNARE复合物形成障碍。其具体机制可能为:锰致细胞内钙离子超载,活化Calpain,特异性地裂解SNAP-25;同时促使α-Syn蛋白表达升高,与VAMP-2蛋白结合增加,束缚了VAMP-2与Synaptophysin的正常结合,影响其正常生理功能,干扰SNARE复合物形成,引起突触囊泡融合下降,Glu和GABA释放降低,引发神经毒性。此研究不仅为预防和治疗锰中毒及其他神经退行性疾病提供一定的实验和理论依据,而且在加强锰中毒防治和保护锰接触者健康方面有重要的现实意义。