目的颅神经嵴源性细胞属多能干细胞,具有向多种组织细胞分化的潜能,在胚胎发育早期从神经管迁移并定居于上下颌突,是颅颌面器官、特别是牙齿发育的重要细胞来源,近年来已成为牙齿组织工程研究领域的热点。本实验在体外获取SD大鼠胚胎颌面组织中的外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells, EMSCs),并通过流式分选进行纯化,得到能代表颅神经嵴源性的p75NTR阳性EMSCs,即p75+EMSCs,进而探讨p75+EMSCs的生物学特性和体外分化命运,揭示牙齿发生、发育机制,促进牙齿组织工程的发展进展。方法1 p75+细胞向颌突迁移的组织学原位鉴定取孕12.5 d的SD鼠胚胎,解剖分离颌面组织,固定、脱钙。常规石蜡包埋、切片,苏木精伊红染色、脱水、封片,镜下观察。取上述标本切片,胎牛血清白蛋白封闭,滴加一抗工作液：鼠抗IgG-CD29、 CD44、CD90,鼠抗IgM-Stro-1,兔抗IgG-p75NTR。滴加有荧光标记的二抗工作液孵育,PBS漂洗,激光共聚焦扫描显微镜下观察。2 P75+颌突外胚间充质干细胞体外获取及鉴定取孕12.5d的SD鼠胚胎,体式显微镜下解剖并切取上、下颌突组织,剪碎组织块,消化,离心,弃上清,重悬细胞,接种到含10%FBS的DMEM/F 12(100 μg/ml链霉素和100 units/ml青霉素)培养基中,恒温培养箱培养。待P1代EMSCs细胞长至80%时,用自带荧光的p75NTR抗体标记,流式细胞技术分选,收集p75+EMSCs及p75-EMSCs。分别从细胞形态、细胞周期、流式鉴定等方面对p75+EMSCs的多向分化潜能进行鉴定,并与p75-EMSCs、EMSCs生物学特性进行对比。3 p75+颌突外胚间充质干细胞体外增殖活性及稳定性研究3.1 p75+EMSCs生长曲线绘制与倍增时间计算取P3代和P9代p75+EMSCs,以1×104/孔接种于24孔板,每组设3个复孔。每日分别取1组,025%胰酶消化、计数,共计11d,绘制生长曲线。细胞群体倍增时间以TD=t×[log2/(logNt-logN0)]计算。3.2 p75+EMSCs增殖活性检测取P3代和P9代p75+EMSCs,分别以1×105/孔和1×103/孔接种到100 ml培养瓶和96孔板上,制备样本,进行细胞周期分析和MTT检测,观察p75+EMSCs的体外增殖活性,对比分析p75+EMSCs在体外扩增过程中增殖活性变化。3.3 p75+EMSCs细胞周期的检测取P3、6、9代p75+EMSCs、p75-EMSCs及EMSCs,用含1%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化,离心,70%冰乙醇固定,4℃下放置12h,流式细胞技术检测细胞周期时相,记录并分析三种细胞各期比例。3.4 P75+EMSCs细胞表型分析取P3、6、9代p75+EMSCs、p75-EMSCs及EMSCs,借助流式细胞技术分别检测p75NTR、Stro-1、CD29、CD44、CD90、CD105、CD146、 CD45的表达,鉴定p75+EMSCs的纯度、干细胞特性以及细胞表型的体外稳定性。统计学方法：采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析,对p75+EMSCs的PDT、MTT及流式细胞周期活性进行独立样本t检验,以双侧P<0.05为差异有统计学意义。4 p75+颌突外胚间充质干细胞体外分化研究取P3代p75+EMSCs、p75-EMSCs及EMSCs,细胞裂解后,分别提取总蛋白,Western Blot检测神经嵴源性细胞表面标志物：AP-2β；平滑肌细胞表面标志物：α-SMA;成牙相关基因：Barx-1、Dlx1、Dlx5;以及成牙骨质特异性基因：CD339和DKK1；从蛋白水平探讨p75+EMSCs的体外分化命运和影响因素,明确其颅神经嵴源性,分析其与成牙启动关系的调控作用。结果1 SD孕鼠胚胎H.E.染色结果显示,孕12.5 d的颌突组织外周为一薄层上皮细胞,中间为大量的间充质细胞,未见上皮内陷或牙样上皮组织出现。激光共聚焦显微镜观察发现,孕12.5 d鼠胚颌突组织内p75NTR、Stro-1 CD29、CD44、CD90呈强表达。2 p75+EMSCs分选的阳性率为6.1%,分选后p75+EMSCs生长状态良好,细胞呈均匀成纤维细胞形态。流式细胞技术鉴定结果：分选前EMSCs的p75NTR、Stro-1的阳性检出率分别是30.20%、84.49%；分选后即p75+EMSCs中p75NTR、Stro-1的阳性检出率分别是96.90%、96.62%。3 p75+EMSCs生长曲线呈“S”型,细胞分裂增殖能力强,无明显的生长滞缓期。MTT分析显示：P3代p75+EMSCs在第5至第7天的OD值较P9代略有升高,其他时间点的OD值基本一致。细胞周期分析结果显示,P3代、6代、9代p75+EMSCs在S期细胞比例分别为24.65%、16.21%、20.77%,差异较小。间充质干细胞特异性标志物CD29、CD44, CD90、CD105、CD146、Stro-1、p75NTR在p75+EMSCs中均高表达(>90%),显示了分选所获得的p75+EMSCs具有良好的间充质干细胞特性。4 Western Blot检测显示,成牙启动相关基因Barx-1、Dlx1、Dlx5、神经嵴源性细胞表面标志物AP-2β在p75+EMSCs中表达高于p75-EMSCs和未分选的EMSCs,平滑肌细胞表面标志物α-SMA在p75+EMSCs中表达低于p75-EMSCs和未分选的EMSCs,成牙骨质特异性蛋白CD339和DKKl在p75+EMSC表达与p75-EMSCs和未分选的EMSCs无显著差异。结论SD鼠受孕12.5d时,颅神经嵴细胞已经迁移至颌突组织,但牙齿发育尚未启动。通过流式分选,可以在体外获得代表颅神经嵴源性的EMSCs,即p75+EMSCs,其具有较强的增殖活性和较好的生物学稳定性,且未见向平滑肌细胞分化现象。通过Western Blot实验发现,p75+EMSCs的成牙启动基因表达明显增强,表明p75NTR可能参与牙发育启动的调控。