利用诱导子技术提高烟草毛状根中茄尼醇含量的研究

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目的:烟草除用于制造卷烟外,还是心血管疾病防治药物辅酶Q10(CoQ10)的化学合成前体物茄尼醇的最主要原料。烟叶中茄尼醇含量为0.3%-3%左右,但烟叶次生代谢物种类丰富,从中较难提取高纯度的茄尼醇。毛状根生长迅速,可以合成次生代谢物。本研究用四种发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染烟草叶片诱导产生毛状根,探讨适合烟草毛状根诱导的适宜菌株,以诱导子作为调控因子对烟草毛状根的生长和茄尼醇积累进行研究,筛选对烟草毛状根生长和茄尼醇积累诱导效果更好的诱导子。方法:本研究利用四种发根农杆菌诱导烟草无菌叶片,筛选适合烟草毛状根诱导的菌株。在接种量和基本培养基两个方面优化培养条件,以获得生长迅速、茄尼醇含量相对较高的烟草毛状根根系,通过PCR分子检测农杆菌基因rolB验证是否发生农杆菌基因的转移。在培养的0d,9d,18d分别添加5μM,10μM,20μM,50μM的H2O2和10μM,50μM,100μM,200μM的水杨酸(SA),研究烟草毛状根茄尼醇诱导的适宜诱导子以及其添加时间和浓度对烟草毛状根生长量茄尼醇含量的影响,并通过荧光定量PCR分析茄尼醇生物合成关键酶基因的表达水平,研究诱导子促进烟草毛状根茄尼醇积累的分子机制。结果:1.选取R1601、A4、LBA9402、15834四种农杆菌菌株感染烟草叶片,LBA9402的诱导效率最高,用稀释1倍的光密度值为0.6(OD=0.6)的农杆菌侵染10分钟,毛状根的转化效率达到97.6%。对276个独立的烟草毛状根根系根据生长量和主要次生代谢物含量进行筛选,筛选出15个生长迅速,侧根数目多的毛状根根系,其中编号为2262的根系培养30天后,生长量达到9.441±0.388 g,烟碱含量为27.84±2.28 mg/g,绿原酸含量为8.494±0.499 mg/g,茄尼醇含量为0.687±0.034 mg/g。2.在接种量和基本培养基两个方面对烟草毛状根的培养条件进行了优化,初始接种量为200根时,毛状根生长迅速,基本培养基为B5时生长量达到12.0±0.25g/L。3.在烟草毛状根培养的不同时间添加不同的诱导子,对毛状根生长量和茄尼醇含量都有诱导作用,H2O2的诱导效果优于SA。在培养的第9 d添加20μM的H2O2,收获时细胞干重比对照增加15.2%,添加10μM的H2O2,茄尼醇含量达到55.068±6.186 mg/L,为对照的4.2倍。在H2O2添加后16 h,茄尼醇合成的关键酶SPS、DXR、IPI的表达量达到最高,最终导致茄尼醇的合成增强。结论:筛选出诱导效率较高的菌株LBA9402和长势较好编号为2262的根系;接种量为200根时,在B5培养基上烟草毛状根生长迅速。H2O2能显著诱导烟草毛状根中茄尼醇的含量,在培养的第9 d添加10μM的H2O2,茄尼醇含量为对照的4.2倍,茄尼醇生物合成的关键基因被诱导表达。
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