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背景:急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是一种以自身消化、水肿、出血甚至坏死为主要症状的急性炎症反应,然而AP的发病机制目前尚未完全阐明。研究证实,钙超载参与了胰腺的炎症、水肿以及腺泡细胞自噬空泡形成等AP特征性病理变化。钙库操纵性钙通道（store-operated calcium channel,SOCC）广泛存在于非兴奋细胞中,是介导AP初始阶段持续性Ca2+内流的主要通道。钙释放激活钙离子通道（calcium release-activated calcium channel,CRAC）是近年来发现的最具有代表性的一种SOC通道,它由钙释放激活钙通道调节分子1（calcium release-activated calcium channel modulator 1,CRACM1,又称Orai1）和基质交感分子1（stromal interacting molecule 1,STIM1）两种蛋白组成。然而目前CRAC介导的钙库操纵性钙内流（store-operated calcium entry,SOCE）与AP的相关性及其机制尚不明确。胰腺腺泡细胞空泡化是急性胰腺炎的典型特征之一。研究发现,腺泡细胞内形成的大量空泡为自噬来源。自噬是引起胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原异常激活的原因之一。然而胰腺腺泡细胞SOCE引起的钙超载是否与自噬具有直接的相关性,还有待于进一步明确。钙调磷酸酶（calcineurin,CaN）是一种Ca2+/钙调蛋白（calmodulin,Ca M）依赖的蛋白磷酸酶,在某些生理或病理情况下,细胞内Ca2+浓度升高可导致其激活。CaN的激活通过促进靶蛋白的去磷酸化从而调节相应生理或病理性进程。转录因子EB（transcription factor EB,TFEB）是CaN的靶蛋白,近期的研究证实TFEB是大量自噬相关蛋白的转录因子,可以参与自噬的调控。然而,AP过程中SOCE能否通过激活CaN激活TFEB,进而调控AP腺泡细胞自噬空泡的形成,目前尚未见报道。目的:本研究旨在通过采用雨蛙肽构建胰腺腺泡细胞钙超载模型以及动物胰腺炎模型,从形态及功能上研究STIM1和Orai1介导的SOCE与AP过程中空泡形成的相关性,并探讨SOCE引起AP腺泡细胞自噬空泡形成的分子机制。方法及结果:1.Orai1介导雨蛙肽引起的SOCE,并加重胰腺自噬空泡的形成采用蛋白免疫印迹（Western blotting）的方法检测胰腺腺泡腺泡细胞STIM1和Orai1蛋白的表达,结果显示胰腺腺泡细胞内源性表达STIM1和Orai1蛋白;共聚焦钙离子成像显示:雨蛙肽可以引起胰腺腺泡细胞的SOCE,用Orai1抑制剂GSK7975A抑制Orai1通道开放后,SOCE被明显抑制;在体实验中,用GSK7975A抑制Orai1,胰尾取材后进行HE染色并对其进行组织病理评分,结果显示GSK7975A可以明显减轻雨蛙肽造成的炎症、水肿及腺泡细胞空泡的形成。2.雨蛙肽通过促进STIM1、Orai1的相互作用激活SOCE为了进一步从形态上验证雨蛙肽可以通过促进STIM1、Orai1的相互作用来激活SOCE,本研究构建了胆囊收缩素A型受体（cholecystokinin receptor-type A,CCKAR）质粒,并通过激光共聚焦钙离子成像技术验证其功能;在293T细胞上共转CCKAR-CFP、STIM1-YFP和Orai1-m Cherry质粒后,采用活细胞共聚焦成像技术观察显示:雨蛙肽与CCKAR作用可以引起STIM1和Orai1蛋白的共定位,形成典型的“puncta”结构。3.CaN介导了雨蛙肽引起的胰腺损伤为了明确CaN激活与AP的相关性,在小鼠AP模型中用FK506抑制CaN的激活,胰尾取材后进行HE染色并对其进行组织病理评分,结果显示:抑制CaN可以明显减轻雨蛙肽造成的炎症、水肿及腺泡细胞空泡的形成。4.CaN的激活依赖于STIM1-Orai1介导的SOCE活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T-cells,NFAT）常用来检测CaN是否被激活。为进一步明确CaN激活与SOCE的相关性,在Hela细胞中共表达NFAT1-GFP和CCKAR-m Cherry质粒,共聚焦活细胞动态成像技术观察显示:雨蛙肽可以促使NFAT从胞浆向胞核转位;去除细胞外Ca2+、阻断Orai1以及抑制CaN激活均可以抑制NFAT的核转位。对胰腺腺泡细胞进行CaN活性检测,结果显示:去除细胞外Ca2+或阻断Orai1以及使用CaN抑制剂均可以抑制CaN的激活。这些结果提示,CaN的激活依赖于STIM1-Orai1介导的SOCE。5.TFEB可能参与胰腺炎过程中自噬体形成增多的过程为了观察AP发展过程中自噬的变化,采用Western blotting的方法检测了胰腺炎造模前后自噬空泡形成相关蛋白LC3Ⅱ及SQSTM1/P62水平的变化,结果显示:胰腺炎造模后LC3Ⅱ及SQSTM1/P62蛋白水平明显升高。采用Realtime-PCR的方法进一步检测自噬相关蛋白转录水平的变化,结果显示:LC3及SQSTM1/P62基因表达明显增高。研究发现TFEB过表达可以促进自噬相关蛋白的转录激活并诱发自噬,同时TFEB是LC3及SQSTM1/P62的转录因子。采用Western blotting的方法对TFEB蛋白水平进行检测显示:AP造模后TFEB蛋白表达明显增多。TFEB激活转录取决于其胞浆向胞核的转位。为了验证胰腺炎过程中,雨蛙肽能否通过促进TFEB核转位来激活自噬相关蛋白的表达,采用Western blotting的方法分别对TFEB在胰腺腺泡细胞胞浆、胞核中的变化进行了检测,结果显示:雨蛙肽作用后胞浆、胞核中TFEB蛋白水平均明显升高。6.CaN激活促进TFEB的核转位为了进一步验证雨蛙肽与TFEB核转位的相关性,在Hela细胞共表达CCKAR-mCherry和TFEB-EGFP质粒或在胰腺腺泡细胞中过表达AAV-TFEB-EGFP,共聚焦活细胞动态成像技术观察显示:雨蛙肽可以促使TFEB-EGFP从胞浆向胞核转位。为了探讨雨蛙肽引起的TFEB核转位与CaN的相关性,采用电穿孔转染或腺病毒转染的方式,分别在Hela细胞过表达CCKAR-mCherry和TFEB-EGFP,在胰腺腺泡细胞中过表达TFEB-EGFP后,用GSK7975A和FK506分别抑制SOCE和CaN,共聚焦活细胞成像结果显示:GSK7975A和FK506均可以明显减少雨蛙肽诱导的TFEB入核。采用Western blotting的方法进一步检测核内TFEB蛋白水平变化,结果显示:FK506和GSK7975A均可以有效减少雨蛙肽诱导的TFEB入核。上述结果提示CaN的激活可以介导TFEB的去磷酸化入核。7.抑制CaN可以减少自噬体的形成为了进一步验证CaN激活对自噬体形成的影响,急性分离胰腺腺泡细胞后,用FK506抑制CaN的激活,采用Western blotting的方法检测LC3Ⅱ蛋白水平的变化,结果显示:FK506可以部分抑制雨蛙肽引起的LC3Ⅱ蛋白水平的升高。由于CaN的激活受STIM1-Orai1介导的SOCE的调控,为进一步验证抑制SOCE对自噬体形成的影响,急性分离的胰腺腺泡细胞后,用GSK7975A抑制Orai1的激活,Western blotting分析显示:抑制SOCE同样可以部分抑制雨蛙肽引起的LC3Ⅱ蛋白水平的升高。结论:雨蛙肽通过促进STIM1和Orai1的相互作用引发SOCE,从而导致胰腺腺泡细胞的钙超载;SOCE引起的钙超载激活CaN,继而导致转录因子TFEB的转录激活,加重AP过程中胰腺自噬空泡的形成。