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目的:生存在骨髓微环境即微龛(niche)中的造血干细胞(HSCs)为所有成熟血细胞的原始造血细胞,其具有高度自我更新能力与多向分化潜能。微龛极其复杂,由基质细胞及其前体间充质干细胞(MSCs)、细胞因子、细胞外基质等组成,它们对于HSC生理功能的调控起着重要的作用。niche主要分为“成骨微龛”和“血管微龛”,前者主要维持HSC静息状态,后者可以调节HSC增殖、分化、迁移等。骨形态发生蛋白(BMP)-2是转化生长因子(TGF-β)超家族中的一员,是一个多功能蛋白,作为重要的成骨因子可刺激MSC分化为成骨细胞,构成“成骨niche”的主体结构,此外它还能促进血管的形成,关于它在成骨niche中的研究较多,而其在血管niche方面的作用研究较少。BMP-2在造血调控中也起重要作用,关于其在胚胎期造血中的研究较多,而其在成人造血中的作用研究得较少。目前关于MSC促进HSC增殖的研究较多,而关于BMP-2对MSC促进HSC增殖的影响的研究较少。本研究通过transwell非接触共培养CD34+细胞与MSC,并用BMP-2干预,在第三天时检测HSC的增殖指标,可以了解MSC和BMP-2对CD34+细胞增殖的影响以及BMP-2信号通路对MSC促进HSC增殖的影响。这能为骨髓CD34+细胞体外扩增的深入研究提供依据,同时为我们下一步探讨相关机制的研究奠定基础,且这有利于造血干细胞移植(HSCT)的发展及恶性血液病的治疗。方法:①结合MSCs贴壁生长的特性采用全骨髓法体外扩增成人BMMSCs至P3,并用流式细胞术(FCM)鉴定MSCs的表面标志及纯度;②通过密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(MNCs),再用mini MACS磁珠分选仪从MNCs中分选成人骨髓CD34+细胞,并用FCM鉴定其纯度;③利用Transwell小室(微网孔径0.4um)非接触共培养骨髓CD34+细胞与P3代的BMMSCs,并用BMP-2干预,具体分组为:单纯HSC组、HSC+BMP2组、HSC+MSC组、HSC+MSC+BMP2组。培养至72小时收集样本;④用以下方法检测HSC在不同组的增殖情况:计数板计数每组HSC的四个复孔的数目;TRIZOL法提取各组HSC的RNA后测定RNA浓度并计算各组HSC的RNA的含量;实时荧光定量PCR法检测各组HSC的增殖基因Ki67的m RNA水平的表达,PCR的Ct值利用2-△△Ct分析法进行相对定量(RQ)分析;⑤统计学分析方法:所有统计学数据均用SPSS17.0软件进行统计学分析,两两比较用单因素方差分析,均以“均数±标准差(X±SD)”表示,当P<0.05时差异被认为具有统计学意义。结果:①全骨髓法培养的BMMSCs成梭形,贴壁生长,排列成旋涡状;流式细胞术检测显示传至第3代的BMMSCs高表达CD105,而CD45、CD34阴性表达,MSCs的纯度为52.4%。②mini MACS磁珠分选出了较高纯度的CD34+细胞,纯度为81.9%。③各组HSC的计数(×104个):共培养组(3.03±0.50)、HSC+BMP2组(1.70±0.51)均高于HSC单纯培养组(1.2±0.43);共培养+BMP2组(5.29±0.20)高于共培养组(3.03±0.50);P值均<0.05。④各组HSC的RNA量(RNA浓度的单位为ng/ul,总RNA还需×50ul):HSC+BMP2组(138±3.464)及共培养组(163±3.559)高于HSC单纯培养组(113±2.944);共培养+BMP2组(241±3.651)高于共培养组(163±3.559);P值均<0.05。⑤荧光定量PCR法检测HSC的Ki67的m RNA相对表达量,即RQ值:共培养组(3.27±0.08)及HSC+BMP2组(2.44±0.26)高于HSC单纯培养组(1.00±0.13);共培养+BMP2组(5.08±0.20)高于共培养组(3.27±0.08);P值均<0.05。结论:①利用全骨髓法成功培养出MSC;②应用免疫磁珠分选法成功分选出HSC;③BMP-2可以促进HSC增殖;④MSC可以促进HSC增殖;⑤MSC与BMP-2具有协同效应,即BMP-2信号通路可以促进MSC对HSC的增殖作用。