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当前，血吸虫病防治面临的棘手问题之一是宿主缺乏有效的抗再感染免疫力而造成再感染率居高不下。因此，能否控制化疗后再感染问题已经成为血吸虫病防治中的核心问题。人群流行病学和动物模型研究均提示，随着日本血吸虫感染的慢性化进程，宿主出现免疫下调现象。除了血吸虫病外，很多慢性感染性疾病，如利什曼病，结核病等，也存在免疫下调现象。近几年，一些研究者将这种持续慢性感染状态与CD4~+CD25~+调节性T细胞诱导的抑制性免疫应答联系起来。对曼氏血吸虫慢性感染的研究已经开始涉及CD4~+CD25~+调节性T细胞的免疫调节作用，但迄今为止，在日本血吸虫感染的研究中尚无有关报道。基于日本血吸虫病慢性期的免疫下调现象，结合其它慢性感染性疾病的研究资料，设计本研究，旨在通过对日本血吸虫慢性感染小鼠体内CD4~+CD25~+调节性T细胞抑制功能的了解，进而探讨CD4~+CD25~+调节性T细胞随日本血吸虫感染进程，在细胞表型和功能相关基因上的变化规律，为进一步研究CD4~+CD25~+调节性T细胞在日本血吸虫慢性化过程中的免疫下调机理和血吸虫感染后宿主高再感染率的成因提供实验资料。 首先建立日本血吸虫慢性自然感染小鼠模型，运用免疫磁珠分离纯化获得日本血吸虫慢性感染小鼠肠系膜淋巴结和脾脏组织的CD4~+CD25~+调节性T细胞，在有丝分裂原ConA(刀豆蛋白A)和特异性抗原SEA(日本血吸虫可溶性虫卵抗原)刺激下，采用同位素~3H-TdR掺入细胞增殖实验分析CD4~+CD25~+调节性T细胞对其它细胞(包括肠系膜淋巴结或脾脏中除CD4~+CD25~+调节性T细胞外的所有单个核细胞)增殖的抑南京医科大学硕士学位论文制作用。再以双色流式细胞术检测不同感染时期(虫卵沉积前期、感染急性期、感染慢性期卜J、鼠肠系膜淋巴结和脾脏组织中，cD4+CD25十调节性T细胞相对比例上的变化规律，同时运用实时荧光定量PCR方法检测各个感染时期相关基因CD25在CD4+T细胞mRNA中的变化;为初步探索CD4℃D25斗调节性T细胞的作用机制，我们再以实时荧光定量PcR方法检测cD4+cD25+调节性T细胞特异性转录基因FoxP3的 mRNA水平，并结合现有的基因芯片结果，检测cD4℃D25+调节性T细胞相关负调控分子CTLA一4的基因在CD4+T细胞中的变化规律。所有实验均设同期未感染小鼠为正常对照组。 本实验获得如下主要实验结果:1.日本血吸虫慢性感染小鼠体内的CD4+CD25+调节性T细胞受抗原利 激后具有抑制其它细胞增殖的功能.在日本血吸虫慢性感染小鼠和正 常小鼠体内，分离高纯度的CD4+CD25+调节性T细胞，在有丝分裂 原ConA刺激下，均表现出对其它细胞显著的抑制效率。受特异性杭 原SEA的作用，感染慢性期小鼠体内获得的CD4+CD25+调节性T细 胞对其它免疫细胞增殖的抑制率可达65%，而正常小鼠CD4+CD25+ 调节性T细胞对其它细胞的抑制率仅达到20%。在无抗原刺激下，细 胞增殖甚微。而且无论有无抗原刺激，单纯CD4+CD25十调节性T细 胞培养均无明显增殖现象。这种慢性感染后的cD4+CD25千调节性T 细胞，可能由于受日本血吸虫杭原尤其是SEA的激活，通过抑制其 它细胞增殖而参与日本血吸虫免疫下调作用。2.在日本血吸虫感染慢性期，CD4十CDZ犷调节性T细胞数量占琳巴结 和脾脏组织单个核细胞的比例，尤其CD旷T细胞的相对比例上调， 同时CD25基因的mRNA水平上调.在日本血吸虫感染急性期，相 对于正常小鼠:CD4+CD25+调节性T细胞在淋巴结和脾脏组织单个 核细胞和CD4+T细胞中的比例均显著下降;而在感染慢性期该细胞 比例回升，甚至在CD4+T细胞中的比例高于正常小鼠。同时CD25 基因在CD旷T细胞mRNA中的转录水平随感染进展不断上调。述其 原因可能由于CD4+CD25+调节性T细胞活化后，抑制其它细胞增殖， 导致CD4+CD25十调节性T细胞数量比例的相对上调;或者可能由于南京医科大学硕士学位论文 CD25基因表达增加后CD4+CD25斗调节性T细胞的生成增加;或许 两者共同发挥作用。3.在日本血吸虫感染慢性期，cD4+CD25+调节性T细胞特异性转录基 因Fox户的mRNA显著增加.在日本血吸虫感染过程中，与同期正 常组刁、鼠相比，感染组小鼠肠系膜淋巴结和脾脏组织内CD4+T细胞 中转录基因Foxp3的mRNA在感染急性期已经上调，至感染慢性期 显著高于正常小鼠(p<0.01);尽管转录因子仅存在于转录过程中， 但是它们相对于功能基因的表达具有至关重要的作用。在日本血吸虫 感染慢性期，可能通过转录因子Foxp3的高表达，激活cD旷cD25+调 节性T细胞相关功能基因的表达，从而活化了CD4+CD25十调节性T 细胞而发挥抑制功能。4.cD旷CD25+调节性T细胞相关的负调控分子cTLA一4基因在日本血 吸虫成虫产卵后高表达，并一直维持到感染慢性期.结合基因芯片结 果，运用R工PCR方法进一步证明，伴随成虫产卵，小鼠脾脏CD4+T 细胞中CTLA一4的mRNA转录水平开始增高，并一直持续到感染慢 性期。RT-PCR和基因芯片两种实验方法所获结果体现完全一致变化 趋势。作为活化CD4+CD25+调节性T细胞的特征之一，负调控分子 CTLA一4的mRNA水平增高可能增强了CTLA一4分子的