【背景】子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)作为一组子宫内膜上皮性恶性肿瘤严重威胁女性健康,以起源于子宫内膜腺体的腺癌最为多见。它是女性生殖系统最多见的恶性肿瘤之一,在我国其每年的发病率约占女性生殖系统癌症的20%~30%,且每年有接近20万的新发病例,发病率仅次于宫颈癌。但在一些西方发达国家有大样本统计显示其发病率远高于宫颈癌,在女性生殖系统癌症排名首位。虽然目前EC的具体发病机理仍不完全明确,但随着近年来明显上升的发病率及死亡率,其早已成为当前基础科研及临床研究的焦点。热休克反应是在热应激作用下发生的,以基因表达和调控变化为主要特性的一种防御应激反应。热休克转录因子1(heat shock transcription factor 1,HSF1)为热休克反应的主要调控者。HSF1可通过直接或间接介导体内许多细胞活性因子的生物活动,参与调控细胞的多种生理机能。它的存在使机体在适应不利环境尽可能延长生存期的同时还参与细胞恶性转化,因此,对肿瘤的发生和发展具有一定推动作用。X-染色体连锁凋亡抑制因子1(XIAP associated factor 1,XAF1)是一种可以拮抗X-染色体连锁凋亡抑制蛋白(X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)的重要的负性调节因子,可直接与XIAP结合而迅速阻断其抑制凋亡的作用,从而逆转XIAP对细胞包括肿瘤细胞的保护作用。鉴于XAF1结构和功能上的众多特质,它已成为降低肿瘤细胞耐药性,提高肿瘤细胞对化疗药物、细胞因子治疗和放射线治疗敏感性的重要突破点。细胞凋亡的阻滞与恶性肿瘤的发生及细胞耐药性的产生关系密切,许多化疗药物都是通过诱导细胞凋亡而达到清除肿瘤的目的。因此当XAF1呈高水平表达时即可导致大量肿瘤细胞的凋亡,显著增强化疗药物的作用并有效抑制肿瘤细胞的转化和体内肿瘤的形成。那么在子宫内膜癌中HSF1与XAF1表达情况如何?这两者之间具有怎样的相关性?这两者是否对肿瘤细胞的增殖及凋亡具有影响作用?带着这些疑问,我们设计了本实验,实验中我们验证了HSF1与XAF1在子宫内膜癌组织及细胞中的表达情况,发现了这两者之间的相互关系,并于慢病毒感染后的子宫内膜癌细胞株中观察细胞的增殖、细胞周期及凋亡等的变化情况,探讨此两种分子在子宫内膜癌发生发展中的作用并对其作用机制进行初步探究,以期为子宫内膜癌的及时诊断、治疗及预后评估提供参考。【目的】1.研究并探讨HSF1与XAF1在子宫内膜癌组织及细胞中的表达及相互作用情况。2.研究并探讨HSF1与XAF1对子宫内膜癌细胞增殖,细胞周期及细胞凋亡的影响及作用。【方法】1.应用免疫组织化学染色法(SP法)检测正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织中HSF1与XAF1的表达情况以及在子宫内膜癌不同分化水平状态下HSF1与XAF1的表达情况。运用统计学方法分析上述组织中HSF1、XAF1的表达与EC临床病理特征的关系并对两者的相关性进行分析。并通过对EC组织与正常子宫内膜组织的western blot及q PCR实验进行HSF1与XAF1基因蛋白水平及m RNA水平的检测。2.通过免疫印迹实验对子宫内膜癌研究中常用的三株细胞(Ish-ikawa、HEC-1A、RL95-2)进行HSF1与XAF1基因表达水平的检测,选取表达量相对稳定的子宫内膜癌细胞RL95-2作为慢病毒感染模型,并成功构建了稳定干涉HSF1基因的细胞株和稳定过表达XAF1基因的细胞株。3.通过western blot及实时定量PCR实验检测HSF1干涉实验组Lv-sh-HSF1-RL95-2细胞中XAF1表达变化;同时检测XAF1过表达实验组Lv-XAF1-RL95-2细胞中HSF1表达变化。4.通过MTT比色实验,流式细胞仪检测及细胞凋亡水平检测来测试HSF1被干涉与XAF1基因被过表达后子宫内膜癌细胞RL95-2在增殖能力,细胞周期及细胞凋亡中所出现的变化。实验分为两个部分,第一部分为HSF1基因干涉组,具体分组如下:实验组Lv-sh-HSF1-RL95-2;组内对照Lv-scramble-RL95-2;空白对照组control。第二部分为XAF1基因过表达组,具体分组如下:实验组Lv-XAF1-RL95-2;组内对照Lv-cherry-RL95-2;空白对照组control。【结果】1.子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织免疫组化染色结果显示:与对照组(正常子宫内膜组织)相比较,HSF1基因在癌组织中的表达水平明显高于正常子宫内膜组织;HSF1在子宫内膜癌组织中高表达,其阳性表达率与组织学分级相关(P<0.001)、肌层浸润及淋巴结转移相关(P<0.05),与手术病理分期不相关;XAF1在子宫内膜癌组织中低表达,其阳性表达率与组织学分级、肌层浸润、手术病理分期及淋巴结转移相关(P<0.05)。在初步验证了两者在癌与非癌组织中的表达后,我们又在不同分化程度的癌组织中也进行了相关实验,免疫组化染色实验结果显示:随着癌组织分化水平的降低,HSF1基因的表达呈现逐渐增高趋势,而XAF1基因的表达则呈现降低趋势,以此结果我们设想它们很可能在子宫内膜癌发生发展过程中分别参与并起到了一定的作用,为了能够进一步的探寻其在癌症发生发展中的作用,我们通过收集的完整病例资料进行了相关性统计学分析,统计学分析结果显示两者之间呈现出负相关关系(r=-0.582,P<0.001)。2.体外环境中,HSF1及XAF1在子宫内膜癌三株细胞中的表达水平通过western blot实验结果显示:在这三株细胞中,Ish-ikawa中HSF1表达水平最高,RL95-2次之,HEC-1A最低,而XAF1在Ish-ikawa中表达水平最低,RL95-2次之,HEC-1A最高,因此我们选取了RL95-2细胞作为慢病毒感染的对象,以保证实验结果的稳定和真实性,在实验条件下得到最准确的结果。3.HSF1干涉实验组Lv-sh-HSF1-RL95-2细胞中XAF1表达较对照组明显增高;同时XAF1过表达实验组Lv-XAF1-RL95-2细胞中HSF1表达较对照组无明显变化。4.基于前期HSF1及XAF1负相关实验结果以及成功构建的稳转细胞系为基础,课题组通过MTT比色实验绘制细胞生长曲线,在HSF1基因干涉组中实验组Lv-sh-HSF1-RL95-2组细胞的增殖能力明显降低,而对照组Lv-scramble-RL95-2,control细胞的增殖能力显著高于实验组(P<0.05)。在XAF1基因过表达组中稳定过表达XAF1的Lv-XAF1-RL95-2组细胞增殖能力也相比较其他对照组显著降低(P<0.05)。5.细胞周期检测实验结果显示:实验分组同上,在HSF1基因干涉组中实验组与两个对照组(Lv-scramble-RL95-2,control)相比较,实验组(Lv-sh-HSF1-RL95-2)出现了明显的G1期阻滞,进入S期的细胞数量减少,干涉HSF1基因后子宫内膜癌细胞RL95-2出现了细胞周期阻滞。在XAF1基因过表达组中稳定过表达XAF1的Lv-XAF1-RL95-2组细胞与Lv-cherry-RL95-2组和control组相比较,实验组Lv-XAF1-RL95-2出现了明显的G1期阻滞,进入S期的细胞数量减少,稳定过表达XAF1基因可以导致子宫内膜癌细胞RL95-2也同样出现细胞周期阻滞。6.细胞凋亡检测实验结果显示:在XAF1基因过表达组中稳定过表达XAF1的Lv-XAF1-RL95-2组与Lv-cherry-RL95-2组和control组相比较,实验组Lv-XAF1-RL95-2出现了明显的早期凋亡趋势(P<0.001),这说明稳定过表达XAF1基因可以导致子宫内膜癌细胞RL95-2在早期就出现大量凋亡。在HSF1基因干涉组中,实验组与两个对照组(Lv-scramble-RL95-2,control)相比较,实验组(Lv-sh-HSF1-RL95-2)出现了与过表达组相一致的结果(P<0.001),实验组细胞早期凋亡明显增加,实验说明干涉HSF1基因后子宫内膜癌细胞RL95-2出现了细胞早期凋亡率的增加。【结论】HSF1及XAF1基因参与了多种人类相关疾病的进展过程,其中就包括肿瘤。在多种肿瘤中都有其对细胞增殖,周期和凋亡中发挥作用的研究。目前,这两者在子宫内膜癌中的相互关联以及这种关联在疾病发生发展过程中的作用还尚未有明确报道。本课题组通过对两者的表达以及表达所存在的关联进行了分析,并通过体外实验验证了两者在子宫内膜癌发生发展中的作用及其发生的机制,所有结果都提示在子宫内膜癌中针对HSF1及XAF1基因为靶点的研究很可能为疾病的基因治疗提供新的靶点,同时为突破目前子宫内膜癌治疗的瓶颈提供新的方向。