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甜菜夜蛾(Spodoptera exigua(Hü bner)),又名白菜褐夜蛾,玉米叶夜蛾,属鳞翅目夜蛾科,是一种世界性的多食性、暴食性害虫,防治较为困难。围食膜(Peritrophic membrane,PM)作为昆虫天然的物j里屏障,具有避免微生物侵染,隔离并过滤毒素等作用。破坏围食膜就可能使昆虫因:处于不正常的生理状态而最终导致其死亡。昆虫中肠围食膜上大量的糖基化位点可能充当了病原物的吸附位点而阻止病原物同上皮细胞结合,而这些糖基化位点大都位于昆虫肠粘蛋白IIM(insect intestinal mucin)上。因此,可以将昆虫IIM作为害虫防治的潜在靶标位点,通过影响IIM正常结构及功能从而破坏昆虫中肠围食膜,以达到防治害虫的目的。
本研究以甜菜夜蛾中肠围食膜肠粘蛋白SeIIM8为研究对象,利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统成功构建基因seiim8的重组载体Bac-iim8,感染昆虫细胞系BTI-TN-581-4(High Five)并成功表达重组蛋白。Western blot检测表明,表达的重组蛋白分子量约为120kDa。ExPASy Proteomice Server进行SeIIM8蛋白结构域分析,发现其含有6个几丁质结合功能域(CBD),1个粘蛋白结构域(MD),1个天冬氨酸-赖氨酸富集区(DKD)和7个TQAPTT重复。
从甜菜夜蛾围食膜蛋白总抗体中成功分离得到SeIIM8的特异抗体,利用此特异抗体检测重组蛋白的几丁质结合活性,发现SeIIM8具有较强的几丁质结合活性;利用1%Calcofluor,6 M urea,2%SDS+5%β-mercaptoethanol,50 mM冰乙酸,PBS洗脱与几丁质结合的肠粘蛋白,发现1%Calcofluor,6 M urea等强变性剂对SeIIM8蛋白的洗脱能力强。
RNAi作为研究基因功能的一种:有效技术已经被广泛应用。本研究根据seiim8基因序列,体外合成特异性的dsRNA,并注射到昆虫幼体血腔中,发现seiim8基因的表达可能受到了抑制。