一、研究背景和目的阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii,CS),隶属于肠杆菌科,是寄生在人和动物肠道内的一种有周生鞭毛,能运动,兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。该菌主要引起婴幼儿,尤其是早产儿发生脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的感染,死亡率高达40%-80%,感染的幸存者易造成严重的神经系统后遗症。自1961年报道了2例由克罗诺杆菌引起的脑膜炎病例,以后相继在世界范围内报道了一系列新生儿感染事件。2004年我国安徽阜阳劣质婴幼儿配方奶粉事件引起政府的高度重视,并且首次从87份婴幼儿配方奶粉中分离到11株该菌,检出率达12.6%,小孩出现头部肿大和反应迟钝,可能该菌在致病中起到重要作用。目前氨苄青霉素联合庆大霉素或者氯霉素是治疗克罗诺杆菌感染的金标准。但抗生素的广泛应用,有其必然的危害：1)抗感染药物治疗容易导致人体微生态平衡失调；2)产生耐药性；3)绝大多数抗感染药物是针对微生物设计而相对忽略了宿主在抗感染中的主导作用。因此补充和替代抗生素治疗的药物和方法研究也越来越受到关注。目前阪崎克罗诺杆菌如何通过肠屏障造成中枢神经系统感染,仍不清楚,但在新生儿脑膜炎的发生过程中,阪崎克罗诺杆菌首先定植于新生儿肠道,之后才会穿透肠屏障和血脑屏障,引起菌血症和脑膜炎,所以预防阪崎克罗诺杆菌穿透肠上皮细胞入血,也成为有效预防其引发菌血症和脑膜炎的关键环节。在此基础上,益生菌常作为预防和抗菌治疗的补充或替代,尤其在防、治各种致病菌与条件致病菌在肠道的黏附、侵袭和生长繁殖方面发挥了极大优势。益生菌又称为微生态制剂或活菌制剂,根据2003年欧洲食品与饲料协会的定义,益生菌指当摄入充足数量后,能对宿主产生一种或多种已被证实有功能性健康益处的活的微生物,主要包括乳杆菌属、双歧杆菌属、丙酸菌、芽孢杆菌属、酵母菌等。研究证实益生菌可预防和治疗多种感染性疾病,其机制主要包括：直接与致病微生物相互作用,通过替代、排斥和竞争机制抑制致病菌生长和黏附定植；调节肠道微生态,促进内环境共生稳态；通过空间位点和营养竞争等阻断其对肠黏膜诱导破坏和血行转移,发挥其抗感染作用；诱导结肠Mucin基因表达的上调,肠道黏膜表面粘蛋白的分泌增多,从而拮抗致病菌的粘附侵袭和跨细胞易位转移。如将益生菌应用于早期新生儿脑膜炎的预防或治疗,可克服广谱抗生素的诸多缺点。最近己有研究首次证明益生菌鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG, LGG)能抑制E coli Kl株在新生大鼠肠道黏附与入侵,从而显著降低菌血症与脑膜炎发生率。但是益生菌是否能够抑制阪崎克罗诺杆菌黏附与入侵,从而降低菌血症与脑膜炎发生率,目前仍不清楚。本研究选择鼠李糖乳杆菌和新型益生菌脆弱拟杆菌作为研究对象。其中LGG是从健康人肠道分离出的1株乳杆菌,是人类研究最广泛的益生菌之一。它能生活在胃肠道,且黏着率高,定植能力强,并具有高效降胆固醇,促进细胞分裂,调节和平衡肠道菌群功能,加强对感染的自然防御,对改善多种肠道疾病有积极作用。脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis, BF)是人体常见的厌氧菌,无芽孢、无动力,有产肠毒素和不产肠毒素两大类。产肠毒素的菌株研究较多,可能会导致人和动物发生腹泻,而不产肠毒素的脆弱拟杆菌能在人体肠道定植。对儿童有促进生长发育和提高免疫力的作用,可增强肠上皮细胞的屏障功能,对消化道和呼吸道某些常见病和多发病有明显的治疗效果,是一种新型活体生物制剂,有消除肠道炎症的作用、治疗腹泻、自闭症等功能。综上,本研究的主要目的：评价鼠李糖乳杆菌(LGG)和分离自某健康足月新生儿粪便的脆弱拟杆菌(BF SK08)两种益生菌能否抑制阪崎克罗诺杆菌黏附和侵袭小肠上皮细胞(Caco-2),从而预防和治疗克罗诺杆菌引起的菌血症和脑膜炎。(1)体外利用Caco-2细胞模型,检测阪崎克罗诺杆菌对Caco-2细胞的黏附、侵袭性及两种益生菌对Caco-2细胞的黏附性能。(2)采用竞争排斥置换法,探讨两种益生菌抑制阪崎克罗诺杆菌黏附侵袭Caco-2细胞的作用,确定益生菌黏附抑制阪崎克罗诺杆菌侵袭Caco-2细胞的方式。(3)运用western blot验证两种益生菌对主要粘蛋白基因MUC-2表达的调节作用,益生菌能否拮抗阪崎克罗诺杆菌诱导的粘蛋白基因表达下降,发挥其拮抗致病菌黏附侵袭作用。(4)益生菌抑制阪崎克罗诺杆菌肠道血源性转移的新生大鼠模型建立及预防、治疗试验。通过以上研究,观察鼠李糖乳杆菌LGG和新型脆弱拟杆菌SK08两种益生菌能否抑制阪崎克罗诺杆菌引起的菌血症和脑膜炎,初步探讨益生菌抑制致病菌的黏附、侵袭和预防血行转移入脑是否与调节肠道粘液蛋白基因表达相关。二、研究方法1、体外阪崎克罗诺杆菌黏附、侵袭实验体外利用小肠上皮细胞Caco-2作为黏附侵袭检测对象,具体方法为；感染前接种Caco-2细胞,待长至单层(约105),细菌接种物用不含抗生素的培养基重悬。以每孔1×107的细菌量放入培养Caco-2细胞的24孔板内(使细胞感染倍数为100),在37℃,5%C02培养箱中共同孵育90 min。为了计算黏附细胞的细菌数,细胞用培养基洗3次,加入100μL 0.5% Triton X-100裂解细胞,孵育8 mmin后,立即加入50μL蒸馏水。在溶解细胞之前的孵育和清洗阶段,单层细胞尽量要保持完整。反复吹打后吸出样品,做梯度稀释(10-2-10-4)后涂苯唑西林和氨苄西林抗性平板计数菌落数。黏附率=胞内细菌数/孵育细菌数×100%,重复三次取平均值。对于侵袭实验,以每孔1×107CFU的细菌量放入培养好Caco-2细胞的24孔板内(使细胞感染倍数为100),在37℃,5%CO2培养箱中共同孵育90min。用培养基洗3次,再用含量为100μg/mL庆大霉素的培养基孵育1 h,以杀死细胞外的细菌。用培养基洗3次,加入100μL 0.5% Triton X-100裂解细胞,孵育8 min后,立即加入50 μL蒸馏水,溶解细胞。反复吹打后吸出样品做梯度稀释(10-1-10-4)后,涂苯唑西林和氨苄西林抗性平板计数菌落数。侵袭率=胞内细菌数/孵育细菌数×100%,或者相对侵袭率,重复三次取平均值。2、益生菌抑制阪崎克罗诺杆菌黏附、侵袭实验参照文献采用竞争排斥置换实验,设置对照组和实验组,对照组：Caco-2与ATCC 29544共孵育3h；实验组分为3个不同处理组：(1)竞争组：Caco-2 +ATCC 29544+益生菌(BF SK08或LGG)共孵育3h；(2)置换组：Caco-2 +ATCC 29544共孵育1h,再加益生菌(BF SK08或LGG),继续孵育2 h；(3)排斥组：Caco-2+益生菌(BF SK08或LGG)共孵育1 h,再加ATCC29544,继续孵育2 h。实验采用预先培养好的24孔板Caco-2细胞,细胞长到80%(大概105-106细胞量),用致病菌和益生菌按以上分组进行孵育,再用庆大霉素孵育1h, Triton-X 100裂解细胞,涂苯唑西林和氨苄西林抗性平板,培养24 h,计算黏附率、侵袭率。3、益生菌诱导肠上皮细胞MUC-2基因表达实验分四个组,分别为益生菌组、益生菌+致病菌组、致病菌组和对照组,其中益生菌组分为Caco-2+BF SK08, Caco-2+LGG, Caco-2+LGG+BF SK08,益生菌+致病菌组分为Caco-2+BF SK08+ATCC 29544, Caco-2+LGG+ ATCC 29544, Caco-2+LGG+BF SK08+ ATCC 29544,致病菌组Caco-2+ ATCC 29544,对照组则为Caco-2细胞,细胞接种在细胞平皿中长至单层,按上述方法加入ATCC 29544,孵育3 h,将细胞悬液收集,提取蛋白,用Western blot法检测益生菌和致病菌的诱导肠上皮细胞MUC-2的表达。4、阪崎克罗诺杆菌肠道血源性转移的新生大鼠模型参考文献,选择Sprague Dawley乳鼠窝鼠16窝(约160只),2-3日龄,每组20只,分预防实验和治疗实验,具体为：(1)预防实验：窝鼠4窝,分为实验组和对照组,实验组2日龄分别灌胃BF SK08、LGG、BF SK08+LGG,剂量为108 CFU/只,连续灌胃2 d,对照组灌胃同等剂量PBS。3d(5日龄)后,所有鼠均灌胃剂量为108 CFU/只的ATCC 29544。2d后乳鼠处死,分别取肠道内容物、血液、脑脊液,涂平板(苯唑西林和氨苄西林抗性平板或MRS)计数。(2)治疗实验：窝鼠4窝,分为实验组和对照组,所有乳鼠2日龄灌胃剂量为108 CFU的ATCC 29544.3d(5日龄)后,实验组小鼠分别灌胃BF SK08、LGG、BF SK08+LGG,剂量108 CFU/只,对照组灌胃同等剂量PBS。2d后乳鼠处死,分别取肠道内容物、血液、脑脊液。涂板计数(同上)。三、结果1、阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544对Caco-2细胞具有黏附、侵袭性。其中以大肠杆菌E44(E coli Kl株)作为阳性对照,DH5a为阴性对照,经3h黏附后,其黏附作用比阳性对照组E44小(相对黏附率为31.3%),比阴性对照组DH5α大(P<0.05)；待细菌黏附3h后,加入庆大霉素进行侵袭实验检测,结果显示其侵袭作用与阳性对照组E44接近,比阴性对照组DH5a大(P<0.05)。分别在1、3和5h时间点取培养板上细菌涂板,结果显示阪崎克罗诺杆菌在感染细胞3h后对细胞的黏附性和侵袭性最大,随着时间的推移,细菌的黏附能力有所下降(P<0.05)。2、益生菌(鼠李糖乳杆菌LGG和脆弱拟杆菌SK08)抑制阪崎克罗诺杆菌黏附、侵袭Caco-2细胞,且呈剂量依赖性。分别用不同浓度(106,107,108)的BF SK08和LGG进行抑制ATCC 29544黏附、侵袭实验,结果显示随着BF SK08和LGG浓度的增加,阪崎克罗诺杆菌的相对侵袭率明显下降,说明侵入到Caco-2细胞中的致病菌明显减少,抑制作用明显(P<0.05)。采用竞争排斥置换实验,结果表明：与对照组相比,各实验组侵袭率均降低(P<0.05),而竞争和排斥组抑制作用比置换组大,排斥组的抑制作用比竞争组大,统计学具有显著差异(P<0.05),表明BF SK08和LGG两种益生菌对抑制致病菌阪崎克罗诺杆菌4侵袭Caco-2细胞具有一定作用,同时间接指导益生菌的预防效果强于治疗效果。3、用WB法对益生菌拮抗致病菌黏附侵袭的机制进行了初步研究,提取各组细胞总蛋白,采用β-actin做内参,WB法检测益生菌和致病菌诱导肠上皮细胞Caco-2的Mucin基因的表达。结果显示加入益生菌的Caco-2细胞MUC-2基因明显上调,而未加入益生菌组的MUC-2基因表达则显著降低,共同加入益生菌和致病菌的组则基因表达无明显变化,说明益生菌诱导的MUC-2基因表达上调可能成为其拮抗致病菌的保护机制之一。MUC-2随着机体的病理性的改变而发生变化,会出现黏蛋白表达的异常包括黏蛋白的基因水平及其蛋白质水平的改变,硫基化程度的降低、糖基化和蛋白质高级结构与空间结构的改变,从而影响他们的保护功能的发挥,导致疾病的发生。本实验阐明MUC-2基因在人体结肠癌细胞中的生物学功能和进一步研究该基因与益生菌、致病菌之间存在一定关系。说明益生菌对致病菌黏附附侵袭肠上皮细胞的抑制作用离不开宿主本身携带的MUC-2基因的保护作用。4、在阪崎克罗诺杆菌肠道血源性转移的新生大鼠中,同时设置预防组和治疗组,48 h后取肠道内容物、血液、脑脊液标本检测。结果显示,预防组和治疗组中,益生菌+致病菌组乳鼠肠道定植的阪崎克罗诺杆菌数量显著少于对照组(P<0.05),未发生菌血症,脑脊液中也未检测到ATCC 29544株。对照组灌胃致病菌(108CFU)后,预防组20只乳鼠中20只出现菌血症(>105cfu/mL),14只脑脊液中出现ATCC 29544株。治疗组20只乳鼠中20只出现菌血症(>105cfu/mL),15只脑脊液中出现ATCC 29544株。而益生菌预防组20只乳鼠中,LGG组有12只出现菌血症(>105cfu/mL), SK08组有11只出现菌血症(>105cfu/mL),混合益生菌组有11只出现菌血症(>105cfu/mL),三组脑脊液中均没有出现菌ATCC 29544株；益生菌治疗组20只乳鼠中,LGG组有14只出现菌血症(>105cfu/mL), SK08组和混合益生菌组有12只出现菌血症(>105cfu/mL), SK08组和混合益生菌组脑脊液中均没有出现ATCC 29544株,而LGG组脑脊液中有1只出现ATCC 29544株。结果表明：脆弱拟杆菌SK08和益生菌LGG可以抑制致病菌穿透肠屏障,从而减少了进入血脑屏障的细菌数量,用脆弱拟杆菌SK08和益生菌LGG预防和治疗小鼠脑膜炎具有一定效果。四、结论1、脆弱拟杆菌SK08和益生菌LGG能黏附于肠上皮细胞,并能显著抑制阪崎克罗诺杆菌对肠上皮细胞的黏附、侵袭；2、脆弱拟杆菌SK08和益生菌LGG可上调肠上皮细胞粘蛋白MUC-2基因表达,保护肠上皮细胞免受致病菌的损伤,这可能成为拮抗致病菌黏附、侵袭的保护机制之一；3、新生乳鼠体内实验显示,脆弱拟杆菌BF SK08和益生菌LGG可以预防和治疗阪崎克罗诺杆菌引起的脑膜炎；4、结合体内外实验结果,脆弱拟杆菌SK08和益生菌LGG对阪崎克罗诺杆菌引起的脑膜炎预防效果优于治疗效果。