研究背景:肝癌作为发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一,严重危害人类的生命和健康。全球每年新增肝癌病例90万例,同时每年约83万人因肝癌死亡,这使得肝癌成为一个日益严重的全球卫生保健问题。缺乏合适的早期检测生物标志物和有效的治疗手段是肝癌高死亡率的重要原因之一。因此迫切需要发现有效的肝癌诊断标志物和治疗靶点。p27蛋白是一种非典型的肿瘤抑制因子,它通过结合和调节细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的活性调控细胞G0到S期的转变。在很多癌症中,p27蛋白表达量的减少和降解速率的增加会导致细胞的周期紊乱和异常增殖,且与患者的不良预后密切相关。因此研究p27蛋白的降解途径,寻找如何调控p27蛋白的分子机制,将为肝癌的治疗提供新的理论基础和研究策略。本课题研究的DNAJC5蛋白,广泛存在于所有组织中,但在神经组织中含量丰富,并且特异性地定位于突触和网格蛋白包被的囊泡上。其对维护神经组织的正常运转有着重要意义,但是DNAJC5在肿瘤发生发展过程中是否有意义目前为止还未被探讨过。前期我们通过生物信息学和文献调研发现DNAJC5在肝癌组织中高表达,与E3连接酶复合物成员SKP2蛋白存在可能的相互作用,并证实DNAJC5能够促进SKP2的靶蛋白-p27的降解。但是DNAJC5对肝癌发生发展的影响,以及DNAJC5如何调控p27蛋白降解的具体机制还需要进一步研究。因此,研究DNAJC5在肝癌中的作用以及内在分子机制,为肝癌的诊断和治疗提供新靶点和新思路。研究目的:1、检测DNAJC5在肝癌组织中的表达水平。2、研究DNAJC5对肝癌细胞增殖的影响。3、验证DNAJC5与SKP2是否存在相互作用。4、研究DNAJC5通过SKP2调控p27的具体分子机制。5、研究DNAJC5调控p27促进肝癌细胞增殖是否依赖于SKP2。研究方法:1、通过公共数据库分析DNAJC5在肝癌组织中的表达情况,以及DNAJC5的表达水平与肝癌患者预后之间的相关性。收集肝癌临床组织样本,运用免疫印迹和免疫组织化学方法检测DNAJC5在肝癌组织以及相应癌旁组织中的蛋白表达水平。2、通过慢病毒感染系统建立稳定过表达或者干扰DNAJC5的肝癌细胞系。利用Ed U、生长曲线实验、细胞平板克隆形成实验以及细胞周期实验来研究DNAJC5对肝癌细胞增殖的影响。3、利用蛋白质免疫共沉淀的方法验证DNAJC5与SKP2的相互作用,并构建DNAJC5截断突变体,检测与SKP2发生相互作用的关键结构域。4、在肝癌细胞中过表达DNAJC5,检测p27和SKP2表达水平的变化,并在HEK293T细胞中同时过表达DNAJC5和p27,检测p27表达水平的变化,确定DNAJC5可以调控p27的蛋白表达水平。然后使用蛋白质翻译抑制剂（CHX）和蛋白酶体抑制（MG132）处理细胞,检测DNAJC5对p27稳定性的影响。5、在HEK293T细胞中过表达或者干扰DNAJC5,并同时过表达SKP2和p27,利用蛋白质免疫共沉淀的方法验证SKP2与p27的相互作用。在肝癌细胞中过表达或者干扰DNAJC5,利用蛋白质免疫共沉淀的方法验证内源SKP2与p27的相互作用。6、在过表达DNAJC5的稳定细胞系中同时干扰SKP2的表达,利用Ed U、生长曲线实验、细胞平板克隆形成实验以及细胞周期实验来研究DNAJC5对肝癌细胞增殖的影响是否依赖于SKP2的表达。研究结果:1、利用公共数据库分析结果显示,在肝癌组织中,DNAJC5的表达水平高于正常组织,并且DNAJC5的高表达与患者的预后较差相关。临床组织标本检测结果也证明,在肝癌组织中,DNAJC5的表达水平高于对应癌旁组织。2、过表达DNAJC5可以促进肝癌细胞的恶性增殖。反之,干扰DNAJC5会抑制肝癌细胞的恶性增殖。3、DNAJC5与SKP2存在真实的相互作用。4、DNAJC5促进SKP2的靶蛋白-p27的降解。5、DNAJC5通过增强SKP2与p27之间的相互作用加速p27蛋白的降解。6、干扰SKP2能够抑制DNAJC5促进肝癌细胞增殖的能力。结论:1、在肝癌组织中,DNAJC5表达水平较高,并且与患者预后相关。2、DNAJC5可以促进肝癌细胞的增殖,并且是依赖于SKP2。3、DNAJC5与SKP2存在相互作用,并且能够增强SKP2与p27的结合能力。4、DNAJC5促进p27蛋白的降解。