背景:microRNAs在影响心肌肥厚和线粒体功能方面作用显著。既往研究表明,miR-142-3p可通过直接抑制靶基因高迁移率族蛋白1(HMGB1)的表达而抑制心肌细胞的凋亡和纤维化,且在压力超负荷心肌肥厚过程中对心肌发挥保护作用。但其对心脏的能量代谢尤其是对心肌线粒体功能的影响仍不明确。目的:为了进一步明确miR-142-3p对心肌肥厚中线粒体功能的影响,本实验通过在动物和细胞水平构建心肌肥厚模型,人工诱导使心肌细胞中的miR-142-3p表达增多,观察心肌细胞肥大,线粒体密度,线粒体膜电位等变化,同时通过荧光素酶检测明确miR-142-3p的下游靶基因,并对可能的信号通路调控机制进行研究,为心肌肥厚和慢性心力衰竭(CHF)的治疗提供新的视角。方法:1.在体内实验中,使用腹主动脉缩窄术(aotic banding,AB)的方法构建大鼠心肌肥厚动物模型。动物造模4周时对大鼠进行心脏超声检查,根据超声检测指标:心室射血分数(%EF)、室间隔厚度(VIDd/cm)、左心室内径(LVID/cm)、左室后壁厚度(LVPWD/cm)、收缩末期左室后壁厚度(LVPWs/cm)、左心室质量(LV mass)等评估各组心脏功能和心肌肥厚程度,而且还可据此判定压力超负荷心肌肥厚模型构建的成功与否。心肌组织H&E染色和石蜡切片观察各组心脏体积大小、心肌组织厚度和心肌纤维大小以从组织学层面判断各组心肌肥厚的程度。实时定量PCR检测心肌肥厚分子标志物心房钠尿肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)的mRNA表达水平。体外实验中,使用血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)体外诱导原代乳鼠心肌细胞建立心肌细胞的肥大模型,AngII诱导心肌细胞48小时后通过免疫荧光染色计算心肌细胞表面积。实时定量PCR检测心肌细胞中心肌肥厚分子标志物ANP、BNP、β-MHC的mRNA表达水平以评价心肌细胞肥大程度。在体外实验和体内实验中均采用实时定量PCR法检测miR-142-3p和基因SH2B1的messenger RNA(mRNA)的表达水平,使用Western Blotting法检测SH2B1的蛋白质表达水平。2.体内实验中,我们将实验分为三组,分别为:对照组(Sham组),实验组(即AB组),药物处理组(后均简称为AB+miR-142-3p agomirs组)。在压力超负荷心肌肥厚模型构建过程中,分别于2周、4周通过大鼠尾静脉注射miR-142-3p特异性模拟物(miR-142-3p agomir)使大鼠心脏中的miR-142-3p表达水平增加;体外实验中,实验分为三组:对照组(Control组),AngII诱导组,AngII和miR-142-3p mimics共同处理组(后简称AngII+miR-142-3p mimics组)。使用miR-142-3p模拟物(miR-142-3p mimics)转染原代乳鼠心肌细胞8小时,后用AngII诱导上述细胞48小时,达既定时间后常规检测心脏或心肌细胞中心肌肥厚标记物ANP、BNP、β-MHC表达水平,以判定动物和细胞模型是否成功构建,同时检测miR-142-3p表达水平,以确定miR-142-3p模拟物转染是否成功。为了观察miR-142-3p过表达对心肌肥厚中线粒体功能的影响,我们进行了线粒体功能的相关检测:首先用线粒体红色荧光探针(Mito-Red探针)处理细胞,然后通过共聚焦显微镜观察心肌细胞中的线粒体密度变化。红色荧光代表心肌细胞中线粒体的数量,蓝色荧光代表心肌细胞核;然后再通过JC-1染色测定离体心肌细胞的线粒体膜电位(Δψm),正常膜电位呈现红色荧光,而线粒体膜电位的去极化呈现绿色荧光;最后检测各组心肌细胞的呼吸功能(OCR),用寡霉素(2μg/mL)、FCCP(2μM)、AA(4μM)处理的检测心肌细胞中的氧消耗率。3.为了证实miR-142-3p是否对SH2B1的基因表达具有直接的调控作用。首先,通过生物信息学分析软件及数据库对一些相关microRNAs和SH2B1基因表达进行初步的分析预测,直到找到一些相关的特异性microRNA分子。其次,为了证实miR-142-3p是否直接结合SH2B1的3’-UTR,我们通过双荧光素酶报告检测系统,观察miR-142-3p过表达是否可以显著降低含有野生型SH2B1 3’-UTR-miR-142-3p结合位点的荧光素酶的荧光素酶活性,然后把miR-142-3p结合位点的种子序列进行突变,观察是否上述效应是否发生改变。最后,为了进一步研究miR-142-3p是否直接调节SH2B1基因表达,我们通过RT-qPCR和Western印迹分析评估了miR-142-3p对SH2B1的mRNA和蛋白质表达的调节作用。结果:1.在动物实验的观察中,AB组较Sham组相比miR-142-3p表达下调,SH2B1表达上调;细胞实验中,AngII组较Control组相比,心肌细胞中的miR-142-3p表达显著减少,SH2B1表达明显增多,其变化均有统计学意义。2.体内实验中,对各组心脏进行HE染色和显微镜观察后发现AB组心脏大小、心肌组织厚度、心肌纤维大小均Sham组明显增加;而较AB组相比,AB+miR-142-3p agomirs组的上述指标均相应减小。造模4周时对各组大鼠进行超声检查心脏功能发现AB组较Sham组相比心脏功能、心室射血分数(%EF)均降低,而室间隔厚度(VIDd/cm)、左心室内径(LVID/cm)、左室后壁厚度(LVPWD/cm)、收缩期末左室后壁厚度(LVPWs/cm)、左心室质量(LV mass)等均增加;同时较AB组相比,AB+miR-142-3p agomirs组的上述指标变化恰好相反。较AB组相比,AB+miR-142-3p agomirs组的心肌肥厚标记物ANP、BNP、β-MHC和心肌凋亡标记物capased-3的mRNA表达水平均降低。体外实验中,AngII+miR-142-3p mimics组心肌肥大标记物ANP、BNP、β-MHC和心肌细胞凋亡标志物Caspase-3与AngII组相比表达明显减少。用α-actinin染色并用荧光显微镜观察三组心肌细胞形态时发现AngII处理细胞48小时后较Control组心肌细胞体积增加,但在AngII+miR-142-3p mimics组较AngII组相比心肌细胞体积减少。由此可见,心脏中miR-142-3p过表达不仅对压力超负荷心肌肥厚和心功能均具有一定的保护作用,且对AngII诱导的心肌细胞肥大和心肌细胞凋亡也具有一定的抵抗作用。3.体外实验中,AngII组较Control组相比,荧光显微镜观察心肌细胞内红色荧光强度减少,说明细胞内线粒体的密度有所降低;而较AngII组相比,AngII+miR-142-3p mimics组中细胞内线粒体荧光强度有所增加,表明此种情况下心肌细胞内线粒体密度有所增加;较Control组相比,Ang II组的绿色荧光强度增加但红色荧光强度降低,表明此时心肌细胞的Δψm显著降低;而较Ang II组相比AngII+miR-142-3p mimics组中的绿色荧光强度减低但红色荧光强度增加,这表明miR-142-3p模拟物可增加Ang II诱导的心肌细胞中Δψm;在Ang II组心肌细胞的OCR较Control组显著降低,而在AngII+miR-142-3p mimics组较AngII组OCR得到改善。综上,与Control组相比,Ang II组的线粒体密度、线粒体膜电位、线粒体呼吸功能均减弱;而较Ang II组相比,AngII+miR-142-3p mimics组的线粒体密度、线粒体膜电位、线粒体呼吸功能均增强;这些结果表明心肌细胞中miR-142-3p表达上调对Ang II诱导的心肌细胞中线粒体功能的损伤都具有一定程度的保护作用。4.miR-142-3p过表达可以显著降低含有野生型SH2B1 3’-UTR-miR-142-3p结合位点的荧光素酶报告载体的荧光素酶活性。当miR-142-3p结合位点的种子序列发生突变时,将不能产生上述效应;将miRNA-142-3p agomir注入大鼠尾静脉后2周可检测到心肌组织中miR-142-3p表达增加和SH2B1 mRNA和蛋白表达减少。将miRNA-142-3p模拟物转染到新生小鼠心肌细胞(NMCMs)中,定量实时PCR和蛋白质印迹分析显示心肌细胞中miR-142-3p的表达增加和SH2B1表达减少。结论:miR-142-3p对心肌肥厚及线粒体功能具有潜在的保护作用,并可通过调节SH2B1基因表达对压力超负荷心肌肥厚及AngII诱导的心肌细胞肥大发挥保护作用。