具有官修性质的北宋《本草图经》记载石斛“以广南者为佳”,本研究在课题组前期研究基础上,对“以广南者为佳”中石斛在“广南”产区的历史分布进行大量地方志及本草考证、实地考察,并进一步运用色谱分析、活性筛选、转录组等现代技术来实证广西铁皮石斛品质,阐明古人认为石斛“以广南者为佳”的缘由。目的:对石斛“以广南者为佳”的历史进行考证,阐明北宋时期“广南”是指何处,且所指为哪种石斛。进而对广西不同产地铁皮石斛样品的品质进行评价,比较其差异,同时建立其黄酮类成分HPLC特征图谱研究,并与广东丹霞种、福建丹霞种、云南种、浙江种铁皮石斛黄酮特征指纹图谱进行比较,鉴定广西种铁皮石斛特异性成分,为广西铁皮石斛资源的开发应用提供实验依据。在此基础上探讨广西铁皮石斛多糖抗肿瘤、抗氧化活性,重点讨论多糖分子量对抗肿瘤活性的影响,以期初探铁皮石斛多糖具有抗肿瘤高活性的分子量范围。最后利用转录组分析多糖相关合称的基因。方法:1.通过对史料、主流本草及地方志对“广南”石斛历史分布进行考证,并实地考察。2.采用HPLC方法对广西不同产地铁皮石斛样品的甘露糖与葡萄糖峰面积比、甘露糖含量、多糖含量进行比较。3.采用HPLC特征图谱技术,建立广西不同产地铁皮石斛黄酮类成分HPLC特征图谱分析方法,采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)进行相似度分析。4.采用HPLC-MS方法鉴定广西不同产地铁皮石斛黄酮特征性成分。5.采用Fe2+-Vc-H2O2体系氧化法制备不同分子量铁皮石斛多糖片段。6.测定对人肺癌A549、PC9、人肝癌HepG-2、人结肠癌HT-29、人宫颈癌Hela、人胃癌SGC7901等肿瘤细胞增殖的抑制作用,流式测定对Hela细胞凋亡率的影响,荧光定量PCR测定对Hela细胞Bax、Bcl-2 mRNA表达量的影响,在细胞水平开展铁皮石斛不同分子量(652.29～11.10kDa)多糖抗肿瘤活性研究。体外清除自由基的方法研究铁皮石斛不同分子量多糖抗氧化活性的差异。7.转录组学分析广西桂平白石山种源铁皮石斛多糖合成相关基因。结果:1.《本草图经》中“广南”即为广南东路、广南西路暨当今广东、广西。①广西石斛历史分布主要分布于广西的东南部(容县、桂平、梧州、贺州等地)、东北部(桂林)、西北部(百色靖西、凌云县、德保,崇左、河池等地),其中容县“都峤山”、桂平“白石山”者为佳。②南北朝时期韶关已经盛产石斛,至唐代,石斛的产地扩大至广东省多地。在唐代和宋代,广州、韶关、泷州(罗定市)、春州、勤州(阳春市)石斛作为贡品上贡,说明了该地的石斛质量上乘。地方志记载广东石斛主要分布于西北部的清远市的阳山县、连山县,河源市连平县,肇庆市开建县;北部到东北部的韶关市始兴县、乐昌县、乳源县、南雄县,梅州市、英德市;东部到东南部的潮州市、汕尾市、东莞市。③本草考证、实地考察确认了生长于始兴天柱峯、容县都峤山、桂平白石山石上质量佳的石斛为铁皮石斛,即“以广南者为佳”的石斛为铁皮石斛,且天柱峯、都峤山、白石山均为典型丹霞地貌。2.①广西不同产地铁皮石斛甘露糖与葡萄糖峰面积比、甘露糖含量、葡萄糖含量具有显著性差异,其甘露糖与葡萄糖峰面积比为0.33到5.91,在采收期内广西产铁皮石斛甘露糖与葡萄糖峰面积比值为0.33-5.14。采收时间是影响甘露糖与葡萄糖峰面积比的重要因素,且在冬天采收的比值最大,而不同品种对铁皮石斛多糖甘露糖与葡萄糖峰面积比值的影响较小。②广西不同产地、不同采收期样品甘露糖含量为5.20%～30.95%,甘露糖与葡萄糖含量和为11.21%到51.13%,表明广西不同产地样品的多糖含量差异很大。其中以桂林永福县、荔浦县产多糖含量最高,依次为50.50%、51.13%。剔除离群值,广西不同产地铁皮石斛甘露糖含量13.93%～30.94%,多糖含量为29.81%～51.13%。3.建立了广西不同产地铁皮石斛黄酮类成分HPLC特征图谱,通过对照品、图谱峰紫外光谱图、质谱色谱数据,鉴定出广西铁皮石斛中的10个特征成分,分别为新西兰牡荆苷Ⅱ、新西兰牡荆苷Ⅰ、异夏佛塔苷,夏佛塔苷,新西兰牡荆苷Ⅲ、芦丁、芹菜素-6,8-二-C a-L-吡喃阿拉伯糖苷,芹菜素-6-C-β-D葡萄糖苷-8—C-α-L-鼠李糖与芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8—C-β-D葡萄糖苷、槲皮苷、槲皮素。不同产地铁皮石斛所含黄酮类成分的差异主要体现于芦丁与芹菜素-6-C-β-D葡萄糖苷-8—C-α-L-鼠李糖与芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8—C-β-D葡萄糖苷重叠峰的差异。容县、桂平样品芹菜素-6-C-β-D葡萄糖昔-8—C-α-L-鼠李糖与芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8—C-β-D葡萄糖苷重叠峰的相对峰面积明显比芦丁高。南宁市、河池市的芦丁相对峰面积比芹菜素-6-C-β-D葡萄糖苷-8—C-α-L-鼠李糖与芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8—C-β-D葡萄糖苷重叠峰高。桂林永福县的样品不含芹菜素-6-C-β-D葡萄糖苷-8—C-α-L-鼠李糖与芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8—C-β-D葡萄糖苷重叠峰,荔浦县的样品含,但含量很少,而这两地样品芦丁相对峰面积都很高,百色市当地种源含芹菜素-6-C-β-D葡萄糖苷-8—C-α-L-鼠李糖与芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8—C-β-D葡萄糖苷重叠峰,但相对峰面积没有芦丁高,引种的浙江种可以忽略不计。福建丹霞种、韶关丹霞种、浙江种、云南种铁皮石斛黄酮类成分特征图谱与广西不同产地共有模式比较,相似度分别为0.734、0.763、0.658、0.739,可见广西铁皮石斛黄酮类成分指纹图谱共有模式与其他种有一定差异。新西兰牡荆苷Ⅱ、新西兰牡荆苷Ⅰ、异夏佛塔苷峰为广西、福建、韶关、浙江种、云南种铁皮石斛黄酮类成分的共有峰。福建丹霞种、浙江种不含芹菜素-6-C-β-D葡萄糖苷-8—C-α-L-鼠李糖与芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8—C-β-D葡萄糖苷重叠峰;而韶关丹霞种含有,但相对峰面积比芦丁低;云南广南种图谱具明显特异性,芹菜素-6-C-β-D葡萄糖苷-8—C-α-L-鼠李糖与芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8—C-β-D葡萄糖昔重叠峰为最强峰,其他峰少,且峰面积小。4.通过Fe2+-Vc-H2O2体系氧化法降解得到7个主要由甘露糖和葡萄糖组成的铁皮石斛不同分子量多糖片段DOP、DOP1、DOP2、DOP3、DOP4、DOP5、DOP6,分子量分别为 652.29kDa、176.29 kDa、75.92kDa、40.96kDa、33.10kDa、28.48kDa、11.10kDa。这7个多糖片段对DPPH、羟基自由基均具有一定的清除能力,其清除能力和多糖浓度呈现依赖性,随浓度的增大而加强。而这7个多糖片段对DPPH、· OH自由基清除力具有显著差异,DOP(652.29kDa)的清除作用最强。(1)DOP对· OH自由基的清除能力比小分子量的DOP4、DOP5、DOP6强。可以看出分子量大的多糖片段在低浓度时就对·OH有较强的清除力。(2)在浓度为0.5-3.Omg/mL时,对DPPH的清除能力,DOP与DOP1,DOP2,DOP3,DOP4,DOP5比较均有统计学意义(P<0.05)。大分子量DOP对DPPH自由基的清除能力比小分子量的DOP1,DOP2,DOP3,DOP4,DOP5强。5.DOP、DOP1、DOP2、DOP3、DOP4、DOP5、DOP6 对A549、PC9、HepG-2、HT-29、Hela、SGC7901等肿瘤细胞的增殖均具有不同程度的抑制作用,抑制作用随浓度的增加而增强。其中对Hela、HT-29、SGC7901细胞增殖的抑制作用较为显著,且不同分子量多糖片段的抑制作用具有显著性差异。在25-400 μg/mL的多糖浓度之间,分子量为75.92kDa的DOP2对HT-29的抑制作用比其他分子量多糖片段强,在浓度为400 μ g/mL时,抑制率为62.7%;分子量为33.10kDa的DOP4对Hela的抑制作用比其他分子量多糖片段强,在浓度为400 μg/mL时,抑制率为60.4%。DOP5(28.48kDa)对SGC790的抑制作用比其他分子量多糖片段强,在浓度为400 μg/mL时,抑制率为58.9%。其次为HepG-2细胞;对人肺腺癌A549、人肺癌PC9有一定的抑制作用,但不是很显著,且不同分子多糖片段差异性不大。DOP、DOP1、DOP5、DOP6诱导Hela凋亡的凋亡率,与空白组比较,均有统计学意义(P<0.01)。与DOP组比较,DOP1、DOP5组的凋亡率明显高于DOP组,具有统计学意义(P<0.01),DOP6组没有统计学意义(P>0.05)。实验结果表明DOP、DOP1、DOP5、DOP6能诱导Hela细胞的凋亡,且DOP1(176.29kDa)和DOP5(28.48kDa)的凋亡率显著高于 DOP(652.29 kDa)和 DOP6(11.10 kDa)的。DOP、DOP1、DOP5、DOP6对体外培养细胞Hela细胞的Bcl-2、BaxmRNA表达的影响,荧光定量检测结果表明,不同分子量多糖片段在100μg/mL浓度下干预Hela细胞24h,与空白组比较,Bax mRNA表达量上调,而Bcl-2 mRNA表达量则下调。Bax与Bcl-2的比值增大,而促进细胞凋亡。且DOP、DOP1、DOP5、DOP6对Bcl-2和BaxmRNA表达影响有显著性差异,且Bax与Bcl-2的比值的增加趋势与MTT检测Hela细胞增殖的影响趋势是一致的。即铁皮石斛多糖在分子量为176.29～28.48kDa的范围内诱导Hela细胞凋亡的活性较高。6.本研究应用高通量测序技术对铁皮石斛茎的转录组进行测序,获得45012条独立基因(Unigenes)。将这些独立基因与公共数据库Nr、Swissprot、KOG、KEGG进行比对注释,获得注释的Unigenes分别为23685条、17925条、14887条、9100条。在Kegg数据库中得到注稀的9100条Unigenes,其中298条在与植物多糖合成与代谢相关的通路[Starch and sucrose metabolism(淀粉与蔗糖代谢)及 Fructose and mannosemetabolism(果糖和甘露糖代谢)]中得到注稀,共编码了 52个蛋白。通过SSR分析,从45012条独立基因(Unigenes)得到3887个SSR位点,表明该种源铁皮石斛拥有丰富的SSR位点。为同属物种的分子标记开发及遗传图谱的构建提供了参考。结论:1.《本草图经》“以广南者为佳”中“广南”即为今广东、广西。广东“石斛出始兴”、“天柱峯者为最良”,广西产“都峤山”、“白石山”石上者为良,且所指石斛为铁皮石斛。2.在采收期内,广西不同产地铁皮石斛甘露糖与葡萄糖峰面积比值为0.33-5.14,多数样品的值不在中国药典规定的2.4～8.0范围内,甘露糖含量13.93%～30.94%,在中国药典规定13.0%～38.0%的范围内,多糖含量为29.81%～51.13%,达到中国药典规定不得少于25.0%的标准。而广西为铁皮石斛的道地产地,故建议修改药典中铁皮石斛甘露糖与葡萄糖峰面积比值范围。3.广西不同产地铁皮石斛黄酮类化学HPLC特征图谱分析方法在一定程度上能够反映广西不同产地铁皮石斛黄酮类主要化学成分的组成和比例的差异。初步鉴定出广西铁皮石斛中的10个特征成分,不同产地铁皮石斛所含黄酮类成分的差异主要在芦丁与芹菜素-6-C-β-D葡萄糖苷-8—C-α-L-鼠李糖与芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8—C-β-D葡萄糖苷重叠峰的差异。4.铁皮石斛多糖的抗肿瘤抗氧化活性和分子量的大小有很大的影响,过大或者过小的分子量都不利于其生物活性的发挥。可通过氧化降解法制备分子量范围分布很大的多糖片段。其中分子量较大的粗多糖DOP(652.29kDa)对DPPH、羟基自由基清除能力最强,具有很有的抗氧化活性,是个很好的外源性抗氧化剂。5.铁皮石斛不同分子量(652.29-11.10kDa)多糖对 A549、PC9、HepG-2、HT-29、Hela、SGC7901等肿瘤细胞增殖的抑制作用强弱程度不同,对Hela、HT-29、SGC7901的抗肿瘤活性较高,其活性较强的分子量范围分别为176.29～28.48 kDa、176.29～33.10kDa、176.29～11.1OkDa。且铁皮石斛多糖可诱导Hela细胞的晚期凋亡,可调控Bc l-2和Bax基因,上调Bax/Bc l-2 mRNA比值,可能通过线粒体凋亡途径诱导宫颈癌癌细胞He la凋亡。6.对广西桂平白石山种源铁皮石斛茎进行转录组测序分析,得到独立基团45012条,被注稀到KEGG功能数据库的独立基团占20.22%(9100条),与多糖合成代谢相关的独立基团有298条。