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研究背景: 胃癌(GC)是世界常见的恶性肿瘤之一，在癌症相关死亡中位居第三位，我国是胃癌高发区。胃癌患者生存期短、易复发，肿瘤的侵袭转移是造成胃癌预后差的重要原因。目前认为上皮-间质细胞转化(EMT)在肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用，过程中有多种转录因子(EMT-TFs)的参与，这些EMT-TFs是高度不稳定的蛋白，易被蛋白酶体途径泛素化降解。 FBXO31是F-box蛋白家族成员，参与Skp1-Cullin-F-box(SCF)泛素E3连接酶复合物的形成，能够介导泛素依赖性蛋白酶体降解途径和调节信号转导。我们前期研究发现在胃癌组织中FBXO31的mRNA和蛋白水平明显降低，且低表达与胃癌患者预后差、存活期限短等密切相关。进一步的研究发现，FBXO31高表达能够显著抑制人胃癌细胞的转移侵袭能力，但具体的机制有待进一步研究。 研究目的: 1.探究FBXO31对胃癌细胞侵袭转移能力的调控机制; 2.探讨FBXO31能否通过泛素化依赖性途径降解EMT-TFs，并确定FBXO31与EMT-TFs间相互作用的关键结构域及分子机制。 实验方法: 1.分子及细胞水平的研究 1.1.人胃癌细胞转染FBXO31 siRNA，观察细胞表型变化。然后，将FBXO31 siRNA及高表达质粒分别转染胃癌细胞，细胞划痕和Transwell实验检测FBXO31干扰和高表达对胃癌细胞侵袭转移能力的影响。 1.2.FBXO31 siRNA和高表达质粒分别转染人胃癌细胞，qRT-PCR和Western blot检测细胞中不同EMT-TFs在mRNA和蛋白水平的变化。 1.3.将FBXO31表达载体Myc-FBXO31及F-box结构域缺失的载体Myc-△FBXO31分别与EMT-TF Snail1的表达载体Flag-Snail1共转染胃癌细胞，Western blot和Co-IP检测FBXO31与Snail1的相互作用，并通过泛素化实验检测FBXO31能否引起Snail1的泛素化降解。 1.4.Myc-FBXO31高表达载体分别与Flag-Snail1的野生型和磷酸化位点突变的载体共转染胃癌细胞，Co-IP检测Snail1的降解是否需要发生磷酸化。 2.动物水平的研究 构建筛选FBXO31高表达的稳转细胞系(BGC-FBXO31)，对裸鼠尾静脉注射，6周后观察并分析裸鼠体内肺转移的情况。 3.临床标本的研究 收集77例人胃癌及对应癌旁组织，Western blot检测组织中FBXO31与Snail1的表达并分析二者的相关性。 实验结果: 1.分子及细胞水平 1.1.胃癌细胞FBXO31干扰后细胞呈现长梭形，细胞间粘着性降低。细胞划痕和Transwell实验结果表明，FBXO31沉默能促进胃癌细胞侵袭转移，FBXO31高表达能抑制胃癌细胞侵袭转移。 1.2.FBXO31 siRNA和高表达质粒转染胃癌细胞，EMT-TF Snail1在mRNA水平没有变化，在蛋白水平可被FBXO31下调。 1.3.Co-IP结果显示FBXO31能与Snail1相互结合，且F-box结构域对于二者的相互作用是必需的，体内泛素化实验结果表明FBXO31能引起Snail1的泛素化，进一步研究发现FBXO31与Snail1的相互作用依赖于Snail1的磷酸化。 2.动物水平的研究 动物实验表明高表达的FBXO31能显著抑制裸鼠体内胃癌细胞的侵袭转移。 3.临床标本的研究 Western blot结果显示:与癌旁组织相比，胃癌组织中FBXO31显著低表达，而Snail1显著高表达，二者在胃癌组织中的表达呈显著负相关。 实验结论: 研究结果表明，FBXO31能够泛素化降解EMT相关转录因子Snail1，进而抑制胃癌细胞的侵袭转移能力。在二者的相互作用中，FBXO31的F-box结构域和Snail1的GSK-3β磷酸化基序是不可或缺的。该研究阐明了FBXO31抑制胃癌进展的分子机制，并确定了EMT转录因子Snail1作为FBXO31调节胃癌侵袭转移的新靶点，为以FBXO31途径为靶点的抗肿瘤治疗提供理论依据。