背景及目的白介素-22(IL-22)属于白介素-10(IL-10)细胞因子家族成员,同时具有促进炎症及抗炎双重性质,各种不同因素的作用下,IL-22发挥不同的生物学效应,包括IL-22在局部浓度水平、作用时间的长短以及其所发挥作用的细胞因子网络环境等。香烟暴露(CS)是多种气道疾病发生和发展的重要危险因素,而且,即使戒烟后,这种影响仍继续延续,即气道炎症仍然存在。尽管有关IL-22在呼吸系统疾病中的研究不少,如在博裂霉素诱导的肺纤维化模型中表现出保护作用。然而,IL-22在CS诱导的肺部炎症中的机制尚不清楚。因此,本研究拟通过CS诱导小鼠肺部炎症模型,给予IL-22干预,研究IL-22干预对香烟诱导小鼠肺部炎症的作用及机制。同时拟通过戒烟小鼠动物模型,观察戒烟后小鼠肺部炎症以及相关趋化因子及细胞因子的变化并探讨其机制。方法1.雄性C57BL/6小鼠,随机分为正常对照组(Control).香烟暴露组(CS). IL-22组(IL-22)、IL-22+香烟暴露组(IL-22+CS)及戒烟组(SC),每组各6只。(1)CS组小鼠每天置于舱内,香烟暴露前半小时腹腔注射等体积生理盐水,每次5支香烟,每天4次,两次间隔30分钟,连续暴露3天；(2)正常对照组小鼠暴露于过滤空气,除香烟暴露外,其他条件同CS组；(3)IL-22组小鼠暴露于过滤空气,腹腔注射rhIL-22(按100μg/kg体重剂量),除香烟暴露外,其他条件同正常对照组；(4)IL-22+CS组小鼠除香烟暴露前半小时腹腔注射rhIL-22(按100μg/kg体重剂量)外,其他条件同CS组；(5)SC组小鼠前3天条件同CS组,第4天起暴露于过滤空气,1周后处死小鼠。2.采用Flexivent小鼠肺功能仪,测量小鼠组织衰减(G)、组织弹性(H)及气道阻力(Rn)。3.通过HE及Masson染色观察肺部形态、炎症及气道周围胶原蛋白沉积情况,并进行病理评分。4.使用光学显微镜计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞总数以及通过细胞甩片HE染色进行细胞分类。5.采用Real-Time PCR方法及免疫组织化学检测小鼠肺组织中趋化因子CXC基序受体3CCXCR3)配体、基质金属蛋白酶(MMPs)、白介素-17A(IL-17A)及转化生长因子-β1(TGF-β1) mRNA及蛋白表达水平。6.应用ELISA法测量BALF上清中CXCR3配体、IL-22、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-a)及TGF-β1浓度。结果第一部1L-22对香烟诱导小鼠肺部炎症的作用及机制1.肺功能CS组、IL-22组及IL-22+CS与正常对照组比较,Rn显著增加(0.67±0.08cmH2O.s/ml、0.68±0.08cmH2O.s/ml及0.78±0.10cmH2O.s/ml vs0.52±0.03cmH2O.s/ml,P值分别小于0.01、0.01及0.001)；而G和H则显著降低(G:7.60±0.64cmH2O/ml、6.78±0.89cmH2O/ml及5.59±0.57cmH2O/ml vs9.31±1.89cmH20/ml,P值分别小于0.05、0.01及0.001；H:32.10±2.59cmH2O/ml,28.52±2.22cmH2O/ml及25.66±2.54cmH2O/ml vs46.20±8.11cmH20/ml,P值均小于0.001)。IL-22+CS组与CS组比较,Rn显著升高(P<0.05),而G和H则显著降低(P值分别小于0.01和0.05)。2.肺组织病理学评分结果光镜下可见CS组和IL-22+CS组出现上皮损伤、小气道壁及肺实质炎细胞浸润、鳞状上皮化生以及胶原蛋白沉积等。根据病理评分标准,CS组、IL-22组及IL-22+CS组与正常对照组比较,病理总评分均显著增高(4.83±1.47、2.67±±0.52及7.00±0.89vs1.33±0.52,P值分别小于0.001、0.05及0.001), IL-22+CS组与CS组比较,病理总评分亦显著增加(P<0.01)。3. BALF炎症细胞总数及分类CS组、IL-22组及IL-22+CS组的炎症细胞总数显著高于正常对照组(16.75±0.88*104/ml、13.08±0.82*104/ml及22.04±1.34*104/ml vs6.25±0.97*104/ml,P值均小于0.001)。IL-22+CS组炎症细胞总数显著高于CS组比较(P<0.001)。在增加的炎症细胞中,以巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞为主。4.肺组织趋化因子或细胞因子mRNA表达水平CS组、IL-22组及IL-22+CS组较正常对照组,以下趋化因子mRNA表达水平显著升高：CXCL9(P值分别小于0.01、0.001及0.01)；CXCL10(P值分别小于0.05、0.05及0.001);而CXCL11仅在IL-22+CS组显著升高(P<0.01),余差异无统计学意义(P>0.05),此外IL-22+CS组CXCL10和CXCL11mRNA表达水平显著高于CS组(P值均小于0.01)。TGF-β1和IL-17A mRNA表达水平仅在CS组和IL-22+CS组显著高于正常对照组(TGF-β1:P值分别小于0.01和0.001；IL-17A:P值均小于0.001),其中IL-22+CS组TGF-β1mRNA表达水平显著高于CS组(P<0.05)。5.肺组织趋化因子或细胞因子蛋白表达水平与正常对照组相比较,CS组和IL-22+CS组在以下趋化因子或细胞因子蛋白表达水平显著升高：CXCL9(3.17±0.41和3.50±±0.55vs1.17±0.41,P值均小于0.001)；CXCL10(2.17±0.41和2.83±0.75vs1.17±0.41,P值分别小于0.01和0.001); CXCL11(3.17±0.41和3.17±0.41vs1.50±0.55,P值均小于0.001),此外IL-22+CS组CXCL10蛋白表达水平显著高于CS组(P<0.05)；TGF-β1(2.67±0.52和3.67±0.52vs1.17±0.41,P值均小于0.001),其中IL-22+CS组TGF-β1显著高于CS组(P<0.01); IL-17A(3.17±0.41和3.33±0.52vs1.67±0.52,P值均小于0.001),而IL-17A在这两组间差异无统计学意义(P>0.05)。6. BALF趋化因子或细胞因子浓度CS组和IL-22+CS组与正常对照组比较,以下细胞因子或趋化因子浓度显著增加：CXCL9(75.13±8.63pg/ml和85.04±8.32pg/ml vs66.33±5.40pg/ml,P值分别小于0.05和0.001)；CXCL10(143.86±5.43pg/ml和152.90±9.34pg/ml vs104.15±4.86pg/ml,P值均小于0.001); CXCL11(53.67±5.26pg/ml和56.34±3.47pg/ml vs44.47±4.15pg/ml,P值分别小于0.01和0.001),此外IL-22+CS组CXCL9和CXCL10浓度显著高于CS组(P值均小于0.05)；IL-8(77.05±4.14pg/ml和92.41±5.22pg/ml vs58.39±7.79pg/ml,P值均小于0.001),其中IL-22+CS组IL-8还显著高于CS组(P<0.001)；TGF-β1(173.63±4.53pg/ml和187.29±3.38pg/ml vs127.06±5.32pg/ml,P值均小于0.001),IL-22+CS组TGF-β1还显著高于CS组(P<0.01)：IL-6(109.78±6.96pg/ml和112.91±9.67pg/ml vs87.74±6.96pg/ml,P值均小于0.001)；TNF-a (407.83±20.69pg/ml和423.54±43.74pg/ml vs343.78±25.95pg/ml,P值分别小于0.05和0.01),而TNF-α在这两组间差异无统计学意义(F>0.05); IL-22(91.52±5.09pg/ml和95.45±3.75pg/ml vs74.53±0.73pg/ml,P值均小于0.001),IL-22+CS组IL-22还明显高于CS组(P<0.05)。第二部戒烟后小鼠肺部炎症的变化及CXCR3配体在其中所起的作用1.肺功能CS组和SC组与正常对照组比较,Rn显著增加(0.67±0.08cmH2O.s/ml和0.65±0.12cmH2O.s/ml vs0.52±0.03cmH2O.s/ml,P值分别小于0.01和0.05)；而G和H则显著降低(G:7.60±0.64cmH2O/ml和6.09±0.99cmH2O/m vs9.31±1.89cmH2O/ml,P值分别小于0.05和0.001；H:32.10±2.59cmH2O/ml和25.59±5.17cmH2O/ml vs46.20±8.11cmH2O/ml,P值均小于0.001)。SC组与CS组比较, G、H及Rn均有降低,其中G和H在两组间差异有统计学意义(P值均小于0.05),而Rn在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。2.肺组织病理学评分结果光镜下可见CS组和SC组出现上皮损伤、小气道壁及肺实质炎细胞浸润、鳞状上皮化生以及胶原蛋白沉积等。根据病理评分标准,CS组和SC组与正常对照组比较,病理总评分显著增高(4.83±1.47和4.17±0.75vs1.33±0.52,P值均小于0.001),而病理总评分在这两组间差异无统计学意义(P>0.05)。3. BALF炎症细胞总数及分类香烟暴露后,CS组炎症细胞总数显著高于正常对照组(16.75±0.88*104/ml vs6.25±0.97*104/ml, P<0.001)。戒烟后SC组炎症细胞总数显著低于CS组(11.54±0.68*104/ml vs16.75±0.88*104/ml, P<0.001),但与正常对照组比较,SC组炎症细胞总数显著增加(P<0.001)。在增加的炎症细胞中,以巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞为主。4.肺组织趋化因子或细胞因子mRNA表达水平CS组和SC组与正常对照组比较,以下趋化因子mRNA表达水平显著升高：CXCL9(P值分别小于0.01和0.001);CXCL10(P值分别小于0.05和0.001),此外SC组CXCL9和CXCL10mRNA表达水平显著高于CS组(P值分别小于0.05和0.01)。CS组和SC组与正常对照组比较,以下MMPs mRNA表达水平显著升高：MMP9(P分别小于0.001及0.05)；MMP12(P分别小于0.01及0.001)；而MMP2mRNA仅在CS组显著升高(P<0.05),此外SC组MMP12mRNA表达显著高于SC组(P<0.001)。TGF-β1mRNA表达水平仅在CS组显著高于正常对照组(P<0.01)。5.肺组织趋化因子或细胞因子蛋白表达水平与正常对照组相比较,CS组和SC组在以下趋化因子或细胞因子蛋白表达显著升高：CXCL9(3.17±0.41和2.67±0.52vs1.17±0.41,P值均小于0.001)；CXCL10(2.17±0.41和2.00±0.63vs1.17±0.41,P值分别小于0.01和0.05)；CXCL11(3.17±0.41和2.83±0.41vs1.50±0.55,P值均小于0.001)；TGF-β1(2.67±0.52和2.17±0.75vs1.17±0.41,P值分别小于0.001和0.01)；MMP2(3.17±0.41和2.33±0.52vs1.17±0.41,P值均小于0.001)；MMP9(3.17±0.41和2.50±0.55vs1.50±0.55,P值分别小于0.001及0.01)；MMP12(2.83±0.41和2.67±0.52vs1.17±0.41,P<0.001),其中CS组MMP2和MMP9表达显著高于SC组(P值分别小于0.01和0.05),余差异无统计学意义(P>0.05)。6. BALF上清趋化因子或细胞因子浓度CS组和SC组与正常对照组比较,以下细胞因子或趋化因子浓度显著增加：CXCL9(75.13±8.63pg/ml和79.45±8.72pg/ml vs66.33±5.40pg/ml,P值分别小于0.05和0.01)；CXCL10(143.86±5.43pg/ml和132.99±6.65pg/ml vs104.15±4.86pg/ml,P值均小于0.001)；CXCL11(53.67±5.26pg/ml和53.82±7.34pg/ml vs44.47±4.15pg/ml,P值均小于0.01),其中CS组CXCL10的浓度显著高于SC组(P<0.01)；IL-8(77.05±4.14pg/ml和77.48±6.64pg/ml vs58.38±7.79pg/ml,P值均小于0.001)；TGF-β1(173.63±4.53pg/ml和161.21±8.68pg/ml vs127.06±5.32pg/ml,P值均小于0.001)；与正常对照组比较,以下细胞因子浓度仅在CS组中显著增加：IL-6(109.78±6.96pg/ml vs87.74±6.96pg/ml, P<0.001); TNF-a (407.83±20.69pg/ml vs343.78±25.95pg/ml, P<0.05).结论第一部IL-22对香烟诱导小鼠肺部炎症的作用及机制IL-22加重香烟暴露小鼠肺部炎症,可能与CXCR3配体、IL-17A等炎症相关趋化因子或细胞因子的存在有关。第二部戒烟后小鼠肺部炎症的变化及CXCR3配体在其中所起的作用香烟暴露引起炎症细胞在肺组织中聚集以及炎症细胞因子升高,戒烟后,炎症细胞及细胞因子尽管有所下降,但仍显著高于正常对照组。戒烟后肺部炎症持续存在,CXCR3配体可能在其中起到关键作用。